Seite in 4 ccm dieser Flüssigkeit 1 Tag bis 3 Wochen,
dann in (womöglich fließendes) Wasser 1 Stunde (besser länger),
dann in destill. Wasser 1 Minute,
dann Härten in allmählich verstärktem Alkohol (S. 17).
~Die zum Fixieren verwendeten Flüssigkeiten können nicht mehr weiter
gebraucht werden; man gieße sie weg.~
§ 5. Härten.
Mit Ausnahme des absoluten Alkohols erfordern sämtliche
Fixierungsmittel eine nachfolgende Härtung der Objekte. Das beste
Härtungsmittel ist der ~allmählich verstärkte Alkohol~. Auch hier gilt
die Regel, reichlich Flüssigkeit zu verwenden, sowie trüb oder farbig
gewordenen Alkohol zu wechseln.
Die in Chromsalzlösungen z. B. in Müllerscher Flüssigkeit
fixierten Stücke geben, wenn nicht lange ausgewaschen wurde
-- und das muß man wegen eintretender Schädigung vermeiden --
noch im Alkohol Stoffe ab, die bei gleichzeitiger Einwirkung
des Tageslichtes in Form von Niederschlägen auftreten; hält man
dagegen den Alkohol im Dunkeln, so entstehen keine Niederschläge,
sondern der Alkohol färbt sich nur gelb, bleibt aber klar. Aus
diesem Grunde ist oben der Ausschluß des Tageslichtes empfohlen
worden; es genügt, die betreffenden Gläser in einer dunklen
Stelle des Zimmers aufzustellen. Auch der 90%ige Alkohol muß, so
lange er noch ~intensiv~ gelb wird, täglich einmal gewechselt
werden.
Die zur Härtung benützten Gläser müssen am Boden mit einer 2-4 ccm
hohen Schicht entfetteter Watte belegt sein, damit das zu Boden
sinkende Wasser nicht in der nächsten Umgebung der zu härtenden Stücke
bleibe. Die genauere Handhabung ist folgende: Nachdem die Objekte (in
einer der oben aufgezählten Flüssigkeiten) fixiert und, je nach Angabe,
in Wasser ausgewaschen sind, kommen sie
in Alkohol 50% 2-6 Stunden,
in Alkohol 70% 12-24 "
in Alkohol 80% 12-24 "
woselbst die Härtung nach weiteren 24-48 Stunden vollendet ist. In
diesem Alkohol können die Objekte bis zur definitiven Fertigstellung
monatelang verweilen.
Die Aufenthaltsdauer richtet sich nach der Größe des Objektes;
unter besonderen Umständen, bei sehr kleinen, zarten Objekten
empfiehlt es sich, diese auf je eine Stunde in 40%, 50%, 60%, 70%
Alkohol einzulegen.
§ 6. Entkalken.
Die zu entkalkenden Objekte können nicht frisch in die
Entkalkungsflüssigkeit eingelegt werden, sie müssen vielmehr vorher
fixiert und gehärtet werden.
1. Zu diesem Zwecke fixiere man kleine Knochen (bis zur Größe von
Phalangen) und Zähne ganz, von größeren Knochen ausgesägte Stücke (von
33 cm Länge)
in ca. 300 ccm Müllerscher Flüssigkeit (6, S. 15) 2-4 Wochen,
oder in 10%iger Formollösung (2, S. 14) 48 Stunden.
Trockne, mazerierte Knochen bzw. Zähne müssen zuerst ca. 12
Stunden in destilliertem Wasser liegen.
2. Nachdem der Knochen 3 Tage (oder beliebig länger) in 90%igem Alkohol
verweilt hat,
kommt er in womöglich fließendes Wasser ca. 24 Stunden,
dann in die Entkalkungsflüssigkeit (konzentrierte Salpetersäure
9 ccm zu 300 ccm Aq. destill.) mehrere Wochen.
Auch hier müssen große Quanten (mindestens 300 ccm) verwendet werden,
die anfangs ~täglich~, später alle 14 Tage zu wechseln sind, bis die
Entkalkung vollendet ist. Man kontrolliert den Prozeß durch Einstechen
mit einer alten Nadel und Einschneiden mit einem Skalpell. Entkalkter
Knochen ist biegsam, weich und läßt sich leicht schneiden. Der
Entkalkungsprozeß nimmt bei dicken Knochen mehrere Wochen in Anspruch,
bei fetalen und kleinen Knochen 3-12 Tage. Nach vollendeter Entkalkung
werden die Knochenstücke entsäuert, d. h. sie kommen
in 5%ige wässerige Lösung von Natriumsulfat 12-24 Stunden,
(Die Lösung ist bei großen Stücken nach 6 Stunden zu wechseln)
dann in (womöglich fließendes) Wasser 24 "
dann abermalige Härtung nach § 5 in allmählich
verstärktem Alkohol.
Bei sehr zarten Objekten (z. B. Schnecken) empfiehlt es sich,
das fixierte und gehärtete Objekt vor dem Entkalken in Zelloidin
einzubetten (siehe Schaffer, Zeitschr. f. wissensch. Mikroskopie
Bd. 19. S. 23).
Anfängern begegnet es nicht selten, daß der Knochen noch vor
vollständiger Entkalkung in Alkohol gebracht wird und dann bei
Schneideversuchen sich noch unbrauchbar erweist. In solchen Fällen muß
dann die Entkalkungsprozedur wiederholt werden. Allzulanges Liegen der
Objekte in der Entkalkungsflüssigkeit führt schließlich zu gänzlichem
Verderben.
§ 7. Schneiden.
Schnitte lassen sich entweder mit dem Rasiermesser oder mit Hilfe eines
Mikrotomes herstellen.
A. Die Rasiermessertechnik.
Das ~Rasiermesser~ (s. S. 8) muß ~scharf~ sein; das Gelingen guter
Schnittpräparate hängt von der Schärfe des Messers ab. Beim Schneiden
muß die Klinge mit Alkohol befeuchtet werden (nicht mit Wasser,
welches die Klinge nur unvollkommen benetzt). Zu dem Zwecke tauche
man das Messer vor jedem dritten oder vierten Schnitte in eine mit
ca. 30 ccm 90%igem Alkohol gefüllte flache Glasschale, die zugleich
zur Aufnahme der angefertigten Schnitte dient. Das Messer ist
~horizontal~ zu halten, leicht zu fassen, der Daumen gegen die Seite
der Messerschneide, die übrigen Finger gegen die Messerrückenseite,
die Handrückenfläche nach oben gerichtet. Zuerst stelle man an dem zu
schneidenden Objekte eine glatte Fläche her, indem man ein Stück von
beliebiger Dicke mit ~einem~ Zuge vom Objekte trennt. Dann beginnt
das Herstellen der Schnitte, die immer mit ~einem~ leichten, nicht zu
raschen Zuge möglichst glatt und gleichmäßig dünn ausgeführt werden
sollen.
Man darf das Messer nicht durch das Objekt ~drücken~, man muß
~ziehen~; zu dem Zwecke muß immer der dem Messergriff zunächst
liegende Teil der Messerschneide an das Objekt angesetzt werden.
Es ist geboten, stets eine größere Anzahl (10-20) von Schnitten
anzufertigen, die mit der Nadel oder durch Eintauchen des Messers in
die Glasschale übertragen werden. Dann stelle man die Schale auf eine
schwarze Unterlage und suche die besten Schnitte aus. Die dünnsten
Schnitte sind nicht immer die brauchbarsten; für viele Präparate,
z. B. für einen Durchschnitt durch sämtliche Magenhäute, sind dickere
Schnitte mehr zu empfehlen. Für Übersichtsbilder fertige man große,
dicke, für feinere Strukturen kleine, dünne Schnitte an; für letztere
genügen oft allerkleinste, durch zu oberflächliche Messerführung
erzielte Bruchstücke von 1-2 mm Seite oder Randpartien etwas dickerer
Schnitte.
Ist das zu schneidende Objekt zu klein, um nur mit den Fingern gehalten
zu werden, so bettet man dasselbe ein. Die einfachste Methode ist das
~Einbetten~ bzw. ~Einklemmen in Leber~.
Man nehme entweder Rindsleber oder besser menschliche Fett- oder
Amyloidleber (aus pathalog.-anatomischen Instituten zu erhalten),
schneide sie in ca. 3 cm hohe, 2 cm breite und 2 cm dicke Stücke, die
man sofort in 90%igen Alkohol wirft, der am nächsten Tage gewechselt
werden muß; nach weiteren 3-5 Tagen hat die Leber die erforderliche
Härte. Nun schneide man eines dieser Stücke von oben her zur Hälfte der
Höhe ein und klemme das zu schneidende Objekt in die so entstandene
Spalte. Ist das Objekt zu dick, so kann man mit einem schmalen Skalpell
Rinnen in die Leber schneiden, in welche das Objekt eingepaßt wird. Das
Objekt bedarf keiner weiteren Fixierung (etwa durch Zubinden mit einem
Seidenfaden oder dgl.).
Ich klemme die meisten Schnittobjekte in Leber; man kann so sehr feine
Schnitte erzielen, sofern man nur einigermaßen Übung hat und die kann
man sich in wenigen Wochen leicht aneignen.
B. Die Mikrotomtechnik.
a) Die Mikrotome.
Die gebräuchlichen Mikrotome sind nach zwei verschiedenen Prinzipien
konstruiert.
Das Prinzip der einen Art besteht darin, daß das zu schneidende Objekt
durch Verschiebung des Objekthalters auf einer schräg aufsteigenden
Ebene gehoben wird.
Bei der anderen Art wird das Objekt in vertikaler Richtung durch eine
Mikrometerschraube gehoben.
Beide Arten von Mikrotomen leisten Vorzügliches[21].
Alle Teile des Mikrotoms sind möglichst sauber zu halten. Bei häufigem
Gebrauche schütze man dasselbe, mit einem leichten Holzkasten bedeckt,
vor Staub. Die Bahn, auf welcher der Messerschlitten läuft, muß
vollkommen rein sein; man putze dieselbe hie und da mit einem in Benzin
getauchten Lappen und fette sie dann mit Knochenöl oder mit Vaselin
so reichlich ein, daß der Schlitten auch bei leichtem Anstoße die
ganze Bahn gleichmäßig durchläuft[22]. Besondere Sorgfalt ist auf die
Messer zu verwenden. Nur mit sehr scharfen Messern wird man Serien sehr
feiner Schnitte herstellen können. Ein wirklich scharfes Messer muß ein
feines Haar, das man an dem einen Ende zwischen den Fingern hält, mit
Leichtigkeit durchschneiden.
b) Die Gefriermethode.
Diese Methode bietet den Vorteil, daß sich relativ rasch gute Präparate
von unfixiertem und fixiertem Material herstellen lassen. Am meisten
verwendet man zur Anfertigung von Gefrierschnitten formolfixiertes
Material, während Blöcke von alkoholfixierten Geweben erst nach Ersatz
des Alkohols durch Wasser, Sublimatmaterial dagegen nur schlecht in
Gefrierschnitte zerlegt werden können.
Am gebräuchlichsten ist folgendes Verfahren:
1. Fixation in 10%igem Formol 24-48 Stunden,
2. Wässern 24 "
3. Schneiden.
Hierzu verwendet man am besten ein kleines Mikrotom (Jungsches
Studentenmikrotom), das mit Gefriereinrichtung geliefert wird.
Das Durchfrieren der Blöcke geschieht mit Kohlensäure, die man
aus einer Bombe durch die Gefriereinrichtung in beliebiger
Geschwindigkeit in der Umgebung des auf dem Objekttisch liegenden
Gewebsblockes ausströmen läßt. Den vorher etwas angefeuchteten
Block drückt man dabei mit der Fingerkuppe leicht an den
Objekttisch an.
Am besten läßt man die Kohlensäure in ganz kurzen, rasch
aufeinanderfolgenden Stößen auf das Objekt einwirken. Dieses muß
langsam vollständig erstarren; man darf deshalb von größeren
Organen nur etwa 0,5 cm dicke Scheiben verwenden. Die Übung lehrt
einen Erstarrungsgrad herausfinden, der die besten Ergebnisse
liefert. Zu stark gefroren, splittert der Block und schädigt
die Messerschneide, zu wenig gefroren schiebt sich das Gewebe
zusammen, so daß man keine exakten Schnitte bekommt.
Bei richtiger Anwendung lassen sich aber tadellose Schnitte von
den allermeisten Objekten herstellen. Man stelle im Durchschnitt
die Schnittdicke auf 10 bis 15 µ ein; allzu dünne Schnitte können
nur bei größerer Übung erzielt werden.
Nach ausreichender Erstarrung hebelt man den Messerhalter
so lange über das Objekt, bis eine gute Schnittfläche
hergestellt ist. Bei richtiger Messerführung hebt sich durch
die Hebelübertragung der Objekttisch bei jedem Schnitt um die
eingestellte Dickenzahl. Die Schnitte, die auf dem Messer
gewöhnlich sehr rasch schmelzen, übertrage man mit einem weichen
Pinsel oder mit der Fingerkuppe in eine Schale mit ausgekochtem
Wasser (bei gewöhnlichem Wasser fangen sich leicht Luftblasen an
den Schnitten). Im Wasser breiten sie sich von selbst wieder aus.
Vorsichtig mit einer gebogenen Nadel aus einem Schälchen in
das andere übertragen, lassen sich die zarten Schnitte den
verschiedensten Färbeverfahren unterwerfen.
Die Gefriereinrichtung ist auch einzeln käuflich und läßt sich an
jedem Mikrotom anbringen.
c) Einbetten.
¿a¿) In Paraffin.
Hierzu bedarf man:
1. ~Paraffin~: zwei Sorten, eine weichere (45° C Schmelzpunkt)
und eine härtere (52° C Schmelzpunkt). Davon stelle man sich eine
Mischung her, die bei ca. 50° C schmelzbar ist. Von dem richtigen
Mischungsverhältnisse beider Sorten hängt viel ab; mancher Mißerfolg
wird nur durch eine ungenügende Mischung herbeigeführt.
Eine genaue Angabe der Mengenverhältnisse läßt sich nicht liefern, da
die Konsistenz des Paraffins in hohem Grade von der äußeren Temperatur
abhängig ist. Auch bedingen härtere Objekte, ferner der Wunsch, sehr
feine Schnitte herzustellen, die Anwendung härterer Mischungen als
gewöhnlich. Für den Winter, bei einer Zimmertemperatur von 20° C dürfte
eine Mischung von 30 g weichem mit 25 g hartem Paraffin[23] den meisten
Anforderungen genügen.