3. ~Paraffinchloroform~, eine gesättigte Lösung (5 g der Mischung in 25
ccm Chloroform). Diese Lösung ist bei Zimmertemperatur flüssig.
4. Ein ~Trockenofen~ (»Thermostat«) aus Kupferblech mit doppelten
Wänden, deren Zwischenraum mit Wasser gefüllt ist. Unter dem Kasten
brennt eine kleine Gasflamme. Oben befinden sich drei Öffnungen;
zwei führen in den erwähnten Zwischenraum, in die eine wird ein
Reichertscher Regulator, in die andere ein Thermometer eingesetzt[24].
Die dritte Öffnung führt in den Luftraum des Kastens. Hier wird ein
zweiter Thermometer eingesetzt.
Der Wärmekasten mit Zubehör ist für denjenigen, der viel mit
Paraffin arbeitet, kaum entbehrlich. Man kann jedoch statt dessen
das Paraffin auf dem Wasserbade schmelzen und durch eine kleine
Spiritusflamme flüssig erhalten.
5. Ein ~Einbettungsrähmchen~. Dasselbe besteht aus zwei geknickten
Metallplatten, die so
[Illustration: Skizze von 2 geknickten Metallplatten]
aneinander gesetzt werden.
Statt dieses Rähmchens kann man sich aus Stanniol oder steifem
Papier (alten Korrespondenzkarten) geformter Kästchen bedienen.
Die einzubettenden Objekte müssen vollkommen wasserfrei sein, 1 bis 3
Tage in mehrmals gewechseltem absolutem Alkohol gelegen haben. Dann
werden sie in Fläschchen mit ca. 20 ccm Chloroform übertragen, woselbst
sie bis zum nächsten Tage, bei kleinen Objekten kürzer, verweilen.
Danach kommen die Objekte in Paraffinchloroform (s. oben) und nach 2
bis 24 Stunden je nach der Größe und Beschaffenheit der Stücke in ein
Schälchen geschmolzenen, aber ~nicht zu heißen~ Paraffins.
Das Paraffin darf nur 2-3 Grade über seinen Schmelzpunkt
erhitzt sein; für die oben angegebene Mischung soll die Luft im
Wärmekasten eine Temperatur von ca. 53° C haben. Hat man das
Paraffin auf dem Wasserbade geschmolzen, so stelle man die Flamme
so, daß die Oberfläche des Paraffins mit einem dünnen Häutchen
erstarrten Paraffins bedeckt bleibt.
Nach etwa einer halben Stunde werden die Stückchen in ein zweites
Schälchen geschmolzenen Paraffins gebracht, woselbst sie je nach der
Größe 1-5 Stunden bleiben.
Das geschieht, um den letzten Rest des Chloroforms aus dem
Objekte zu entfernen. Selbstverständlich muß immer das gleiche
Schälchen für die Übertragung aus dem Paraffinchloroform benützt
werden. Enthält das Schälchen nach häufigerem Gebrauche viel
Chloroform, so kann man dieses durch stärkeres Erhitzen des
Paraffins austreiben. So lange das Paraffin noch Chloroform
enthält, steigen von einer eingetauchten heißen Nadel Bläschen
auf.
Nach Ablauf der angegebenen Zeit nehme man einen tiefen Teller, lege
einen Objektträger hinein und stelle auf diesen das mit Glyzerin in
dünner Schicht bestrichene Einbettungsrähmchen, in welches jetzt
Paraffin und Objekt gegossen werden. Dann gebe man, so lange das
Paraffin noch flüssig ist, dem Objekt mit erhitzten Nadeln die
gewünschte Lage. Sobald das geschehen ist, gieße man in den Teller
vorsichtig kaltes Wasser bis zum oberen Rande des Rähmchens; das
Paraffin beginnt sofort zu erstarren, worauf man noch mehr Wasser
zugießt, bis das ganze Rähmchen unter Wasser steht. Durch diese
Manipulation erhält das Paraffin eine homogene Beschaffenheit, während
es sonst leicht kristallinisch wird und dann sowohl schwerer zu
schneiden ist, als auch auf die Struktur der eingeschlossenen Teile
schädlich einwirkt. Nach etwa 10 Minuten werden die Metallplatten
abgenommen und der Paraffinblock bis zur vollkommenen Erstarrung auf
dem Objektträger im Wasser belassen.
Das so eingeschmolzene Objekt ist schon nach einer halben Stunde
schneidbar; soll es später verarbeitet werden, so wird es mit einer
Nadel signiert und kann bis zum Schneiden unbegrenzt lange Zeit
aufgehoben werden.
¿b¿) In Zelloidin.
Das in Platten käufliche (bei Dr. Grübler) Zelloidin hat die Konsistenz
speckigen Käses. Man zerschneide die Platte in kleine Stückchen und
lasse sie an einem staubfreien Orte an der Luft trocknen, wobei sie
gelb und steinhart werden. 16 g dieses trockenen Zelloidins werden in
100 ccm absolutem Alkohol + 100 ccm Äther gelöst. Die Hälfte dieser
8%igen Lösung mit 50 ccm absolutem Alkohol + 50 ccm Äther verdünnt.
Die Hälfte dieser 4%igen Lösung mit 25 ccm abs. Alkohol + 25 ccm Äther
verdünnt.
Alle drei Lösungen sind in gut verschlossenen weithalsigen Flaschen
aufzubewahren. Diese stellt man in gut verschließbare größere
Gefäße, die Alkohol absol. enthalten und auf deren Boden sich 15-20
g weißgeglühtes Kupfervitriol befindet (S. 4). Wenn das Zelloidin zu
sehr eingedickt ist, kann es durch Zugießen von Äther-Alkohol verdünnt
werden.
Nach einiger Zeit werden die Lösungen trüb und milchig; es ist
alsdann besser die Lösung vollkommen eintrocknen zu lassen und
die Stücke von neuem in Äther-Alkohol zu lösen.
Die einzubettenden Stücke müssen vollkommen wasserfrei sein, 1 bis
2 Tage in mehrmals gewechseltem absolutem Alkohol gelegen haben.
Aus diesem werden die Stücke auf je 24 Stunden in Äther-Alkohol
(zu gleichen Teilen) in die 2%ige, 4%ige und 8%ige Zelloidinlösung
übertragen. Hier können die Stücke beliebig lange verweilen. Meist
sind sie nach 24 Stunden hinreichend durchtränkt, nur große, viele
Binnenräume enthaltende Objekte müssen länger (bis zu 8 Tagen)
in der dicken Lösung verweilen. Dann wird das Stück rasch auf
einen Korkstöpsel oder einen kleinen Holzklotz, die man vorher
mit Alkohol-Äther durchtränkt[25], aufgesetzt und etwas Zelloidin
darübergegossen. Dabei ist zu beachten, daß das Objekt nicht fest auf
den Kork aufgedrückt werde, sonst löst es sich leicht ab. Es muß sich
eine 1-2 mm dicke Schicht zwischen Kork und Objekt befinden.
Dicker darf die Schicht nicht sein; auch gut gehärtetes
Zelloidin ist elastisch, eine dicke Schicht solch elastischen
Materials würde zu einem Ausweichen des Objektes beim Schneiden
Veranlassung geben.
Nun wird das Ganze 1/2 Stunde (zarte Objekte) bis 4 Stunden unter eine
nicht fest schließende Glasglocke zu langsamer Trocknung gebracht und
dann in eine Glasdose mit ca. 30 ccm 80%igem Alkohol übertragen. Damit
die Objekte untertauchen, klebe man die Korkstöpsel mit ihrer unteren
Fläche vermittelst Zelloidin an die Innenfläche des Dosendeckels. Am
nächsten Tage wird der 80%ige Alkohol durch 70%igen Alkohol ersetzt, in
welchem die Stücke lange aufgehoben werden können.
Man kann auch die in Zelloidin einzubettenden Stücke zu späterer
Verarbeitung aufheben. Das Objekt wird dann aus dem 8%igen Zelloidin
in ein Schälchen gebracht, das fest zugedeckt mehrere Stunden stehen
bleibt, bis die beim Gießen entstandenen Luftblasen entwichen sind.
Dann nehme man den Deckel ab und lasse das Schälchen unter einer
Glasglocke so lange stehen, bis sich eine Haut auf der Oberfläche
gebildet hat (6-12 Stunden). Dann kommt das Schälchen samt Inhalt
in 70%igen Alkohol; nach 24 Stunden schneidet man aus dem erstarrten
Zelloidin einen das Präparat enthaltenden Block zurecht und konserviert
in 70%igen Alkohol.
Sollen solche konservierten Blöcke auf Kork aufgeklebt werden,
so müssen sie zuvor auf 1/2 Stunde in Alkohol absol., und dann 5
Minuten in dickes Zelloidin eingelegt werden.
Zur Anfertigung feinerer Schnitte kann man das Zelloidin noch ~härten~.
Zu diesem Zwecke bringe man die in Zelloidin eingeschlossenen Stücke
aus dem 70%igen Alkohol auf 2 Tage oder beliebig länger in ein
Alkohol-Glyzeringemisch (Alkohol 80% 1 Teil, reines konzentriertes
Glyzerin 6-10 Teile). Je größer das Verhältnis von Glyzerin zu Alkohol
ist, desto härter wird das Zelloidin.
Man kann die Mischung noch mehr ändern. Als äußerste Grenze
dürfte 1 Teil Alkohol zu 30 Teilen Glyzerin zu bezeichnen
sein; noch stärkere Differenzen führen zu einem starken Rollen
der Schnitte; siehe ferner Neumayers Angabe zur Technik der
Zelloidineinbettung (Zeitschr. für wissensch. Mikroskopie Bd.
XXV, S. 38).
Um das Federn der elastischen Zelloidinblöcke zu verhindern, trockne
man den aus dem Alkohol-Glyzerin entnommenen Block mit Filtrierpapier
sorgfältig ab, mache ein paar seitliche Einkerbungen und tauche ihn in
flüssiges Paraffin. Solche Blöcke lassen sich nicht trocken aufheben.
Man lege sie in das Alkohol-Glyzerin zurück.
Einer besonderen Behandlung bedürfen die mittelst der ~Golgi~schen
Methode fixierten Präparate, da ein länger als eine Stunde dauernder
Aufenthalt in absolutem Alkohol oft schädlich wirkt. Das aus der
Silberlösung genommene Stückchen wird 15-20 Minuten in 30 ccm 96%igem,
dann 15 Minuten in ebensoviel absolutem Alkohol gehärtet, dann auf 5
Minuten in die dünne Zelloidinlösung gebracht. Unterdessen schneidet
man in die plangeschnittene Seitenfläche eines möglichst breiten
Stückes Holundermark eine Vertiefung, gerade groß genug, um das
~ganze~ Präparat eben aufzunehmen, welches hier eingefügt und mit
etwas Zelloidin übergossen wird. Dann setze man ein zweites Stückchen
Holundermark auf, gieße wieder etwas Zelloidin über und stelle das
Ganze auf ca. 5 Minuten zum Antrocknen unter eine Glasglocke. Dann
Übertragung in 80%igen Alkohol auf 5 Minuten und dann mit einem mit
80%igem Alkohol benetzten Messer schneiden. Mikrotom ist durchaus
nicht nötig, es lassen sich leicht mit freier Hand genügende Schnitte
herstellen. Benützt man ein Mikrotom, so soll die Schnittdicke zwischen
40 und 120 µ schwanken. Es empfiehlt sich, an der Schnittfläche so viel
Holundermark abzutragen, daß letzteres nur eine (1 mm) schmale Rinde um
das Zelloidin bildet.
¿g¿) In Zelloidin-Zedernöl-Paraffin.
Diese Methode ist für kleine Objekte, die mit feineren Methoden
untersucht werden sollen (Plastosomen, Vitale Färbung u. a.),
besonders dann zu empfehlen, wenn Schnittserien erforderlich sind,
anderseits die bei Paraffin unvermeidlichen Schrumpfungen vermieden
werden sollen. Zuverlässig arbeitet die Methode besonders bei kleinen
Objekten (bis zu 0,5 cm Kantenlänge bei würfelförmigen Blöcken).
Man braucht drei verschiedene Mischungen von Zelloidin, denen etwas
Zedernholzöl beigemengt ist. Wie beim Zelloidin (s. S. 24) muß bei der
Aufbewahrung dieser Mischungen sorgfältig auf dichten Abschluß gegen
die Luftfeuchtigkeit geachtet werden.
Die Mischungen sollen folgendermaßen zusammengesetzt sein:
Zelloidin I: 4 Teile 2%iges Zelloidin und 1 Teil Zedernöl.
Zelloidin II: 4 Teile 4%iges Zelloidin und 1 Teil Zedernöl.
Zelloidin III: 5 Teile 8%iges Zelloidin und 1 Teil Zedernöl.
Über die Herstellung der Zelloidinlösungen s. S. 23.
Die Objekte kommen aus Alk. abs. auf 24 Stunden in Äther-Alkohol (zu
gleichen Teilen), hierauf nacheinander in die 3 Zelloidinmischungen,
in denen sie je nach der Größe einen Tag bis mehrere Wochen verweilen.
Ganz kleine Objekte, wie Nierenstückchen von 2 mm Kantenlänge habe
ich im Laufe von 2 Tagen mit gutem Erfolge durch die 3 Mischungen
hindurchgeführt.
Aus der 3. Mischung bringt man die Objekte in ein möglichst kleines
Papierkästchen mit so viel von Zelloidin 3, daß die Objekte gerade
damit bedeckt sind. Das Kästchen läßt man dann in einer flachen Schale
auf Chloroform gut zugedeckt etwa 10 Minuten schwimmen, bis sich
durch die Chloroformdämpfe die oberflächliche Schichte des Zelloidins
gehärtet hat. Dann taucht man den ganzen Block in Chloroform unter, bis
er nach 3-4 Stunden ganz durchgehärtet ist.
Wenn man sich davon überzeugt hat, daß der Block gut durchgehärtet
ist, schneidet man vorsichtig das Zelloidin möglichst knapp bis an
die Objektoberfläche weg und bringt das Objekt für 12-24 Stunden in
Chloroform-Paraffin, dem man 3-5 Tropfen Zedernöl (auf etwa 10 ccm)
zugemischt hat. In dieser Mischung stellt man das Objekt oben auf den
Trockenschrank, nachdem unter das Schälchen noch ein umgestülptes Gefäß
gestellt worden ist. Unter allen Umständen muß eine zu starke Erwärmung
vermieden werden.
Dann für je 10 Minuten in Paraffin I und II und Einbetten wie bei
Paraffinbehandlung.
Nur die Übung lehrt, die Konzentration des Zelloidin 3 mit dem
Härtegrad des Einbettungsparaffins so in Übereinstimmung zu bringen,
daß die Schnittfähigkeit ein Optimum erreicht. Aber in den meisten
Fällen erzielt man ausreichende Resultate.
d) Schneiden und Weiterbehandeln der Schnitte.
¿a¿) Paraffinobjekte.
1. Der Paraffinblock wird zuerst ~zurechtgeschnitten~, d. h. durch
schichtweises Abtragen des Paraffins in eine vierseitige Form gebracht.
Hierbei soll ringsherum eine 1-2 mm dicke Paraffinschicht um das Objekt
erhalten bleiben. Auf die Schnittfläche achten!
2. ~Aufblocken~: entweder auf Würfel von Hartholz, die man sich in
passender Größe von jedem Schreiner herstellen lassen kann oder
auf Metalltischchen, die vielfach den Mikrotomen beigegeben sind.
In beiden Fällen überzieht man diesen Träger mit einer ca. 1-2 mm
dicken Paraffinschicht, die heiß aufgetragen wird, setzt unmittelbar
hintereinander mit der rechten Hand einen in einer Spiritusflamme
erwärmten Metallspatel auf die Paraffinschicht des Trägers und mit
der linken Hand die Unterfläche des Paraffinblockes auf den Spatel,
zieht dann unter leichtem Druck auf den Paraffinblock den Spatel unter
diesem weg. Drückt man dann den Paraffinblock auf den Träger fest auf,
so erstarrt das Paraffin wieder; zum Schlusse verstreicht man mit dem
erwärmten Spatel die Berührungskanten von Block und Träger und legt das
Ganze für mindestens 5 Minuten in kaltes Wasser.
Man schneidet den Paraffinblock so niedrig als es die Objektgröße
erlaubt, da mit der Höhe des Blockes die Federung zunimmt, worunter die
Exaktheit der Schnitte leidet.
3. ~Schneiden mit querer Messerstellung.~ Nur weiche und kleine Objekte
lassen sich gewöhnlich so schneiden, daß man das Messer senkrecht zur
Achse des Mikrotoms einstellt. Je nach dem Härtegrad des Paraffins
kann man bei dieser Messerstellung Schnitte von jeder gewünschten
Schnittdicke (2-30 µ) rasch hintereinander schneiden, so daß sie in
Bandform aneinander haften. Dazu ist Voraussetzung, daß die dem Messer
zugewandte Fläche des Blockes mit der Messerschneide und mit der vom
Messer abgewandten Fläche genau parallel steht. Diese Methode erfordert
große Übung. Dem Anfänger sei geraten, jeden Schnitt einzeln vom
Messer zu nehmen; nur, wenn jeder Schnitt gleichmäßig »kommt« ist eine
zuverlässige Schnittdicke erreicht.
4. ~Schneiden bei schräger Messerstellung.~ Handelt es sich um große
Objekte von ungleichem Gefüge, so soll das Messer in einem zur
Längsachse des Mikrotoms möglichst spitzen Winkel festgeschraubt
werden. Die Paraffinsäule muß so zur Messerschneide stehen, daß diese
zuerst eine ~Kante~ der Säule trifft. Der Messerschlitten ist ~langsam~
zu bewegen, jeder Druck dabei ist zu vermeiden.
5. ~Mißstände beim Schneiden und deren Beseitigung.~ Jeder, der mit
Paraffin gearbeitet hat, wird über manchen mißlungenen Versuch zu
berichten wissen.
Oft gleitet das Messer über das Objekt und trennt einen Schnitt
entweder unvollkommen oder gar nicht.
Die Ursache hierfür kann zunächst im Mikrotom liegen. Die Bahn des
Messerschlittens ist nicht sauber (man achte auch auf den vertikalen
Teil der Schlittenbahn), oder das Messer ist nicht scharf genug,
oder es ist an der Unterfläche mit Paraffin beschmutzt. In letzterem
Falle wird der Messerschlitten herausgehoben, das Messer vorsichtig
mit Terpentinöl und einem weichen Lappen gereinigt. Messer mit dünnem
Rücken federn, wenn man den vordersten Teil der Schneide benutzt; so
kommt es, daß bei schräger Messerstellung die Schneide nur im Anfange
des Schnittes eingreift und über den letzten Teil des Präparates
erfolglos weggleitet. Auch eine steilere Einstellung der Messerschneide
durch keilförmige Eisenplättchen oder durch verstellbare Messerhalter
beseitigt oft Schwierigkeiten. Bei Mikrotomen älterer Konstruktion
liegt der Grund oft in ungenügender Feststellung des Paraffinblockes.
In zweiter Linie ist die Ursache im Objekt zu suchen. Dasselbe ist
vielleicht zu hart, oder sehr ungleichen Gefüges, oder schlecht
eingebettet. In letzterem Falle liegen zwei Möglichkeiten vor.
Entweder das Präparat war nicht gehörig entwässert, dann zeigt
es undurchsichtige Flecken, oder es enthält noch Chloroform; in
diesem Falle ist es weich, ein leichter Druck mit der Nadel auf die
Oberfläche des Präparates ausgeübt, hinterläßt eine Delle oder preßt
gar Flüssigkeit aus. In beiden Fällen muß die Einbettungsprozedur in
umgekehrter Reihenfolge bis zum absoluten Alkohol (in letzterem Falle
bis zum Paraffinbade) wiederholt werden.
Endlich kann die Konsistenz des Paraffins schuld sein.
Die Schnitte rollen sich.
Das kann verhindert werden, indem man einen Pinsel oder eine gebogene
Nadel gegen den sich rollenden Schnitt hält. Der Grund des Rollens
liegt in dem zu harten Paraffin, das auch schuld ist, wenn
die Schnitte bröckeln.
Die Brauchbarkeit des Paraffins ist in hohem Grade abhängig von
der äußeren Temperatur. Ist das Paraffin zu hart, so suche man
nicht sogleich durch Beimischung von weichem Paraffin eine passende
Konsistenz herzustellen -- das sei der letzte Ausweg --, sondern
versuche zuvor einfachere Mittel. Man schneide in der Nähe des Ofens
oder (bei Gasbeleuchtung) mit nahegerückter Lampe. Oft führt schon ein
~leichtes~ Erwärmen des Messers zum Ziele.
Selbst ganz gutes Paraffin bröckelt, wenn es mit kaltem Messer
geschnitten wird.
Die Schnitte falten sich und werden zusammengedrückt. Dadurch erhalten
die geschnittenen Objekte eine falsche Form. Der Grund liegt in zu
weichem Paraffin. Öfteres Einlegen des Blockes in kaltes Wasser,
Schneiden im kalten Zimmer (im Sommer in den Morgenstunden) beseitigen
diesen Übelstand.
6. ~Aufkleben der Schnitte.~ Nur dicke Schnitte werden, sofern sie von
einem durchgefärbten Stück stammen, auf den Objektträger gebracht und,
nachdem das Paraffin durch Xylol herausgelöst ist, gleich nach den (S.
45) angegebenen Regeln eingelegt.
In der Mehrzahl der Fälle müssen die Schnitte zuerst aufgeklebt werden.
Die hier zu verwendenden Objektträger müssen ganz ~rein~ sein; man
putze sie mit etwas Alkohol und einem sauberen, ~nicht fetten~ Tuche
oder lege sie auf eine halbe Stunde in kaltes Seifenwasser. Auf den gut
getrockneten Objektträger wird ein kaum stecknadelkopfgroßer Tropfen
Eiweiß-Glyzerin[26] zu einer kaum sichtbaren Schichte verstrichen;
der Objektträger wird dann mit einem Tropfen destilliertem Wasser
beschickt, und die Schnitte werden auf dem Wasser ausgebreitet und
in bestimmter Reihenfolge angeordnet. Beachte dabei die Größe des zu
verwendenden Deckglases! Nun ziehe man den Objektträger durch eine
Spiritusflamme oder bringe ihn 1-3 Minuten in den Wärmekasten. Durch
die leichte Erwärmung breiten sich die Schnitte glatt aus.
Das Paraffin darf nicht schmelzen; die aus geschmolzenem Paraffin
und Wasser entstandene Mischung ist in Karbolxylol nicht mehr
löslich.
Dann ordne man die Schnitte noch einmal mit einer Nadel, lasse durch
leichte Neigung des Objektträgers das überflüssige Wasser abfließen
oder sauge es mit einem Streifen Filtrierpapier ab und lasse das
Ganze, vor Staub geschützt, gut trocknen. Am nächsten Tage wird
der Objektträger mit Xylol übergossen und, wenn die Schnitte schon
gefärbt sind, in Xylolbalsam (S. 45) eingeschlossen. Sollen dagegen
die Schnitte auf dem Objektträger noch gefärbt werden, so wird der
Objektträger aus Xylol in absoluten Alkohol übertragen. Nach ca. 5
Minuten wird der Objektträger aus dem Alkohol genommen, in der Umgebung
der Schnitte rasch abgewischt, angehaucht und entweder in die Farbe
gelegt oder mit einigen Tropfen der Farblösung, z. B. Hämatoxylin
(direkt auf die Schnitte) bedeckt. Von da wird der Objektträger langsam
in eine Schale mit destilliertem Wasser gebracht und dann entweder in
dünnes Glyzerin (S. 44) oder nach bekannter Vorbehandlung mit absolutem
Alkohol und Karbolxylol (S. 45) in Xylolbalsam eingeschlossen.
Ein Ablösen der Schnitte kommt nur dann vor, wenn das Wasser
nicht in genügender Menge -- zwischen Schnitten und Objektträger
muß das Wasser ganz ausgebreitet sein -- zugesetzt war. Man kann
auch auf Deckgläschen aufkleben, dadurch wird das Einlegen in
Farbe, Alkohol usw. weniger kostspielig.
¿b¿) Zelloidinobjekte.
Block und Messer müssen dauernd unter Alkohol feucht gehalten werden.
Der Alkohol soll je nach Bedarf 70-80%ig sein; Alkohol von
niederer Konzentration härtet den Zelloidinblock mehr.
Die Schnitte werden in Alkohol aufbewahrt, man nimmt sie einzeln mit
einem Pinsel vom Messer. Das Messer soll mit einem möglichst langen
Teil der Schneide durch das Objekt gezogen werden, muß also extrem
»schräg« stehen.
Dünne Schnitte, die sich beim Schneiden leicht in Falten legen, breite
man möglichst auf dem Messer noch mit dem Pinsel aus, da länger
vorhandene Falten sich später oft schwer aus den Schnitten wegbringen
lassen.
Das Färben von Zelloidinschnitten wird durch das Zelloidin ziemlich
stark gestört, da sich diese Substanz vielfach intensiv mit färbt;
selbst Hämatoxylin verleiht dem Zelloidin oft einen leicht blauen
Ton und soll deshalb nur in verdünnter Lösung angewendet werden. In
absoluten Alkohol dürfen die Schnitte nicht gebracht werden, da dieses
das Zelloidin löst. Sie werden aus 96%igem Alkohol in Karbolxylol
aufgehellt und in Xylolbalsam eingeschlossen.
Schnittserien von Zelloidinobjekten kommen nur für ganz spezielle
Zwecke, z. B. für das Zentralnervensystem in Betracht. In dieser
Hinsicht seien die Artikel von Weigert[27], von Obregia[28] und
von Maximow[29] bestens empfohlen.
¿g¿) Zelloidin-Paraffinobjekte.
Im allgemeinen wird wie beim Paraffinverfahren aufgeblockt und
geschnitten. Sehr oft macht es aber Schwierigkeiten, die Schnitte
vollständig eben auf dem Objektträger aufzukleben, weil beim Strecken
die umgebende Paraffinschicht ein von dem des eingeschlossenen
Zelloidins abweichendes Ausdehnungsbestreben hat. Man entferne dann
vor dem Schneiden den Paraffinmantel streckenweise und lege auch
beim Serienschneiden jeden Schnitt einzeln auf den Objektträger,
nachdem er schon auf dem Messer möglichst geglättet ist. Mit
dieser Vorsichtsmaßnahme gelingt es fast immer, glatte, tadellose
Schnittserien zu bekommen.
Die Schnitte werden ebenso aufgeklebt wie Paraffinschnitte; nach dem
Entfernen des Paraffins durch Xylol kommen die Präparate in Alk. abs.,
von da zur Auflösung der das Färben störenden Zelloidinschichte in
Alkohol-Äther (zu gleichen Teilen) auf 5 Minuten. Danach lassen sich
die Schnitte allen Färbemethoden unterwerfen wie Paraffinschnitte.
§ 8. Färben.
Im Gegensatz zur technischen Färberei kommt es beim Färben zu
mikroskopischen Zwecken darauf an, verschiedene Bestandteile
des Körpers durch Farbstoffbehandlung deutlicher zu
unterscheiden. Durch geeignete Farbstoffkombinationen gelingt
es, gleichzeitig eine größere Zahl verschiedener Strukturen
durch charakteristische Farbtöne hervorzuheben. Es liegt
nahe, anzunehmen, daß eine chemische Verschiedenheit in der
Zusammensetzung der einzelnen Strukturbestandteile für die
Verbindung mit jeweils bestimmten Farbstoffen verantwortlich sei.
Für die übergroße Mehrzahl der Fälle trifft diese Annahme aber
nicht zu. Trotz großer Bemühungen, eine sichere theoretische
Grundlage für die Färbemethoden zu finden, läßt es sich heute
noch nicht sicher sagen, ob elektrochemische, adsorptive
Oberflächenkräfte oder konstitutionschemische Einflüsse für
gewisse Färbungsergebnisse eine Erklärung abgeben können.
Für Färbeversuche kommt es einmal auf die Eigenschaften und
die Beschaffenheit des zu gelingt es, gleichzeitig eine
größere Zahl verschiedener Strukturen durch charakteristische
Farbtöne hervorzuheben. Es liegt nahe, anzunehmen, daß eine
chemische Verschiedenheit in der Zusammensetzung der einzelnen
Strukturbestandteile für die Verbindung mit jeweils bestimmten
Farbstoffen verantwortlich sei. Für die übergroße Mehrzahl
der Fälle trifft diese Annahme aber nicht zu. Trotz großer
Bemühungen, eine sichere theoretische Grundlage für die
Färbemethoden zu finden, läßt es sich heute noch nicht sicher
sagen, ob elektrochemische, adsorptive Oberflächenkräfte oder
konstitutionschemische Einflüsse für gewisse Färbungsergebnisse
eine färbenden Materials, dann vor allem auch auf die
Eigenschaften der Farbstofflösung an. Ein und dasselbe
Material färbt sich ganz verschieden, je nachdem, ob es
lebend, tot, aber unfixiert, oder ob es endlich fixiert der
Farbstoffwirkung ausgesetzt wird. Ziemlich konstant ist die
Färbung im Lebendzustande, die wir »vitale Färbung« nennen,
ebenso die Färbung fixierter Präparate. Totes unfixiertes und
schlecht fixiertes Material verhält sich je nach den Umständen
sehr verschieden. Geringe, für manche Strukturelemente aber
sehr wesentliche Einflüsse werden von der Art des angewandten
Fixationsmittels ausgeübt. Deshalb werden im speziellen Teil für
bestimmte Färbungen besondere Fixationsmethoden empfohlen.
Aber auch die Auswahl und die Anwendungsart der Farbstoffe ist
von allergrößter Bedeutung sowohl für die vitale Färbung wie
für die Färbung des fixierten Objekts. Die gebräuchlichsten
Farbstoffe werden in saure (oxychrome), basische (basochrome)
und indifferente Farbstoffe eingeteilt; die meisten Farbstoffe
sind Salze, bei denen der Farbcharakter entweder an der Base
(basische) oder an der Säure (saure) haftet. In bestimmter
Anwendungsweise, besonders aus wässeriger Lösung zeigen basische
und saure Farbstoffe eine sozusagen gegensätzliche Wirkung auf
bestimmte Strukturelemente des Gewebes, so daß man im allgemeinen
z. B. die sauren Farbstoffe als Plasmafarbstoffe, die basischen
als Kernfarbstoffe bezeichnet hat. Doch gelingt es, bei etwas
abweichender Methodik die genannte Farbstoffwirkung auch völlig
umzukehren, was davor warnt, in diesen Verhältnissen etwa
chemische Gesetzmäßigkeiten zu erblicken.
Sehr wichtig für die Wirkung des Farbstoffes ist das
Lösungsmittel und die Konzentration, in der er dargeboten wird.
Leicht diffundierende Farbstoffe dringen sehr rasch in die Gewebe
ein, bringen aber für gewöhnlich keine haltbaren Färbungen
hervor. Dagegen geben schwerer diffundierende Farbstoffe eine
Reihe von ausnehmend schönen Kontrastfärbungen, so daß sie
speziell zur Darstellung feinerer Strukturen verwandt werden
können. Solche Kontraste, die sich in wässeriger Lösung der
Farbstoffe erzielen lassen, verschwinden vielfach, wenn man die
Präparate in Alkohol überführt, weil die meisten Farbstoffe in
Alkohol leichter diffundieren, und sich so leichter auch in
vorher ungefärbte Strukturbestandteile ausbreiten können.
Dieselbe Wirkung des Alkohols wird beim Färben sehr oft
absichtlich ausgenutzt, indem man die Präparate in einer
wässerigen Farblösung zunächst »überfärbt«, sie dann im Alkohol
»extrahiert«. Man kann sich dann unter dem Mikroskop von dem
»Differenzierungsgrad« schrittweise überzeugen und die Entfärbung
durch das Fertigmachen des Präparates unterbrechen. Diese Art
des Färbens nennt man regressive Färbung im Gegensatz zur
progressiven Färbung, bei der man von vornherein nur so lange
färbt, bis der gewünschte Effekt erreicht ist.
Die Löslichkeit der Farbstoffe und damit auch die
Färbeeigenschaften werden oft durch bestimmte Zusätze zu den
Farbstofflösungen (Salze u. a.) verändert. Soweit die Färbekraft
durch solche Zusätze erhöht wird, spricht man vielfach von
Beizen. Man kann nämlich einen ähnlichen Effekt erzielen, wenn
man das Gewebe vorher mit dem betreffenden Salz behandelt, statt
das Salz der Farbstofflösung zuzusetzen.
Gerade die Verschiedenartigkeit der unzähligen bekannten
Farbstoffe in bezug auf ihre Lösungseigenschaften und die
Veränderlichkeit dieser Löslichkeit durch bestimmte Zusätze
scheint die Hauptgrundlage der außerordentlich zahlreichen
Färbungsvorschriften zu sein[30].
Bei der Unsicherheit in der theoretischen Deutung der
Färbemethoden sei dem Anfänger empfohlen, sich so genau wie
möglich an die erprobten Vorschriften zu halten. Nur so wird
er es lernen, die schwierige Färbetechnik zu beherrschen. Mit
dem Fortschreiten in der technischen Fertigkeit ergibt sich
ein Eindringen in die theoretischen Grundlagen des Färbens als
notwendig. Bei dem heutigen Stande dieser Grundlagen darf die
Färbemethodik nur als ein Mittel betrachtet werden, bekannte
Strukturen zu verdeutlichen. Ausdrücklich sei davor gewarnt, nur
aus färberischen Eigenschaften sonst unbekannte Strukturen zu
deuten.
~Allgemeine Regeln.~ Vor dem Gebrauche ist die betreffende
Farbstofflösung stets zu filtrieren. Die aus einem Stückchen
Filtrierpapier von 5 cm Seite bestehenden kleinen Trichter werden
einfach durch zweimaliges Zusammenlegen hergestellt und in einen
Korkrahmen gesteckt, den man sich durch Ausschneiden eines Stückes
von ca. 2 cm Seite aus einer Korkplatte von ca. 5 cm Seite verfertigt
hat. Der Korkrahmen wird auf vier lange Stecknadeln gestellt. Solche
Trichter können viele Male benutzt werden; Trichter und Rahmen sollen
nur für eine und dieselbe Flüssigkeit zur Anwendung kommen. Die in die
Farbflüssigkeiten gebrachten Schnitte sollen nicht an der Oberfläche
schwimmen; ~sie sind~ mit Nadeln in die Farbe ~unterzutauchen~.
A. Kernfärbung.
a) von Schnitten und Häuten.
1. Mit ~Hansenschem Hämatoxylin~ (s. S. 7). Man filtriere 3-4 4 ccm der
Farblösung in ein Uhrschälchen, dahin kommen
a) die Schnitte 1-5 Minuten,
werden dann b) in destill. Wasser abgespült 1-2 "
kommen dann c) in mehr (ca 30 ccm) destill. Wasser 5 Min. u. mehr
dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10, 3 (S. 45).
Die Hauptsache ist bei der Hämatoxylinfärbung und bei vielen
anderen Färbungen ~das ordentliche Auswaschen~; ist das Wasser
auch nur leicht blau geworden, so muß es durch neues ersetzt
werden. Anfangs sehen die Schnitte ganz verwaschen blau aus;
meist nach 5 Minuten, manchmal erst nach Stunden erfolgt die
Differenzierung, die schon manche Details mit unbewaffnetem Auge
erkennen läßt. Dabei geht die anfangs blaurote Farbe allmählich
in schönes Dunkelblau über, das um so reiner wird, je länger (bis
24 Stunden) die Schnitte im Wasser liegen.
Die Zeit, in welcher sich die Schnitte färben, ist sehr
verschieden. Schnitte in Alkohol fixierter und gehärteter Objekte
färben sich in 1-3 Minuten. War die Fixierung mit Müllerscher
Flüssigkeit oder mit Kalibichromat-Essigsäure erfolgt, so
müssen die Schnitte etwas länger (bis 5 Minuten) in der Farbe
bleiben. Anfängern ist zu empfehlen, die Schnitte verschieden
lange Zeit, 1, 3, 5 Minuten in der Farbe zu belassen und dann zu
kontrollieren, welche Zeitdauer zu einer gelungenen Färbung die
passende ist.
Nach vollendeter Färbung wird die benützte Farblösung durch das Filter
wieder in die Hämatoxylinflasche zurückgegossen. Das Uhrschälchen ist
sofort zu reinigen.
~Fehler-Korrektur.~ Ist ein Präparat zu stark gefärbt, so kann man das
Hämatoxylin zum Teil wieder ausziehen; die zu dunklen Schnitte kommen
dann
a) in ca. 5 ccm (Uhrschale voll) destilliertes Wasser + 2-3 Tropfen
Essigsäure ca. 2 Minuten,
hier werden die Schnitte rot und heller,
dann b) in ~mehrmals~ zu wechselndes, reines,
destilliertes Wasser ca. 5 Minuten,
hier wird die Essigsäure ausgewaschen, die roten Schnitte werden
wieder blau. Schlecht ausgewaschene Schnitte verblassen nachträglich.
Kombination der Kernfärbung mit Gegenfärbung siehe G. S. 41.
Statt des Hansenschen Hämatoxylins möge auch P. Mayers ~Hämalaun~
(Hämatein pur. Grübler 0,5 g in 25 ccm 90%igem Alkohol durch
Erwärmen gelöst und zusammengegossen mit einer Lösung von
25 g Alaun in 500 ccm destilliertem Wasser) empfohlen sein.
Anwendung wie bei Hansens Hämatoxylin; man kann auch durchfärben
(24 Stunden). Größere durchgefärbte Stücke müssen mit 1%iger
Alaunlösung ausgewaschen werden.
2. Mit ~Anilinfarben~. Aus der großen Reihe seien hierfür empfohlen:
~Vesuvin~ und ~Methylviolett~ B (S. 9). Man filtriere davon ca. 5 ccm
in eine Uhrschale.
Dahin kommen a) die Schnitte 2-5 Minuten,
dann b) in 5 ccm destill. Wasser 1/2 Minute,
dann c) in 5 ccm Alk. absolut 3-5 Minuten,
hier werden die ganz dunklen Schnitte unter viel Farbenabgabe
heller, so daß man einzelne Teile (z. B. bei Haut die Drüsen)
schon mit unbewaffnetem Auge erkennen kann,
dann d) in neuen Alk. absolut ca. 2 Minuten,
dann Einschließen in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).
Der Effekt ist eine sehr schöne, dauerhafte Kernfärbung; der Nachteil
liegt im starken Verbrauche von Alkohol absol.
Ähnlich wird ~Saffranin~ (S. 9) verwendet. Man filtriere davon ca. 5
ccm in eine Uhrschale.
Dahin kommen a) die Schnitte 24 Stunden,
dann b) in 5 ccm Alkohol 96% 1/2 Minute,
dann c) in 5 ccm Alkohol absol. und weiter wie bei Methylviolett B.
Man kann der Saffraninfärbung auch eine Ansäuerung vorausschicken,
d. h. die Schnitte kommen a) in 10 ccm destill. Wasser + 1 Tropfen
reine Salzsäure 5-10 Minuten.
dann b) zum Abspülen in reines, destilliertes
Wasser 1/2 Minute,
dann c) (wie oben a) in die Farbe 24 Std. usw.
Zu langes Verweilen in dem absoluten Alkohol kann bis zu völliger
Entfärbung der Schnitte führen. Mißlingen der Färbung beruht bei
mit Chrom-Osmium-Essigsäure fixierten Objekten auf zu geringem
Essigsäuregehalt dieser Fixationsflüssigkeit.
Kombination der Anilinkernfärbung siehe S. 41, G.
b) von Stücken vor Zerlegung dieser in Schnitte, sog. »Durchfärbung«.
3. Mit ~Boraxkarmin~ (S. 9). a) In 30 ccm dieser Farblösung kommen
Stücke vorher fixierter und gehärteter Objekte,
a) wenn sie klein (5 mm Seite) sind 24 Stunden,
wenn sie größer sind 2-3 Tage,
dann b) direkt in 25 ccm salzsauren
Alkohol (S. 9, _{42}) 1-3 Tage,
dann c) in reinen Alkohol 90% 24 Stunden,
dann d) zum Nachhärten in Alkohol 96% 24 Stunden und mehr.
Der gebrauchte Boraxkarmin wird wieder in die Flasche
zurückgegossen.
Beim Differenzieren in salzsaurem Alkohol wird der Alkohol
nach wenigen Minuten rot -- nur in Chromsalzlösungen (z. B. in
Müllerscher Flüssigkeit fixierte Objekte) geben oft wenig Farbe
ab -- und muß nun durch neuen salzsauren Alkohol ersetzt werden;
nach etwa 1/4 Stunde wird der Alkohol abermals gewechselt;
dieser Wechsel wird so oft wiederholt, bis der Alkohol nicht
mehr gefärbt ist. Das kann 1-3 Tage in Anspruch nehmen; während
des ersten Tages wechsle man alle 2, während der folgenden Zeit
alle 4 Stunden. Wenn man sparsam sein will, kann man mit einer
Nadel das Objekt aus dem roten Flüssigkeitshof, in dem es liegt,
langsam hinausschieben und an eine andere ungefärbte Stelle der
Flüssigkeit bringen.