Participación de los histólogos españoles en el Congreso médico
internacional de 1903 celebrado en Madrid. -- Comunicaciones de
algunos profesores extranjeros y nacionales. -- Demostración
hecha por Simarro de un método nuevo de coloración de las
neurofibrillas. -- Partiendo de este interesante proceder,
doy casualmente con una fórmula sencillísima y constante
de impregnación de las neurofibrillas, de los axones y
terminaciones nerviosas centrales y periféricas. -- Historia de
las tentativas encaminadas al hallazgo de la nueva fórmula y
ulteriores perfeccionamientos de la misma. -- Gracias al nuevo
recurso técnico, consigo confirmar y consolidar definitivamente
descubrimientos anteriores y cosechar numerosos hallazgos.
Fué el año 1903 uno de los de mayor actividad del recién creado
_Laboratorio de Investigaciones biológicas_. Una fiebre de trabajo,
sólo comparable con la sufrida en 1889 y 1890, se apoderó de mí,
embargando todas mis facultades. Nada menos que 14 comunicaciones,
algunas equiparables por su volumen á libros, dí á la estampa
en dicho año, cuya segunda mitad considero como la cúspide de
mi actividad inquisitiva. Y todavía pude, durante la canícula,
disponer de tiempo bastante para emprender, en compañía de mi mujer
y hermanas, un viaje de turista por la encantadora Italia, con
acompañamiento del indispensable aparato fotográfico, y haciendo
escala en Génova, Milán, Turín, Pavía, Venecia, Florencia, Roma,
Pisa, Nápoles y otras admirables ciudades de la patria del arte.
Á tan inusitado alarde de energías contribuyeron poderosamente
dos sucesos afortunados: Primeramente, las sesiones del _Congreso
internacional de Medicina_, celebrado en Madrid durante la primavera
del citado año; y después, allá por el mes de Octubre, el encuentro
fortuito de cierta fórmula de impregnación de las células y fibras
nerviosas, singularmente fecunda en nuevas revelaciones.
El mencionado Congreso internacional obligó, naturalmente, á
movilizar todas las fuerzas de los aficionados españoles á las tareas
del Laboratorio. Importaba desempeñar un papel lo menos desairado
posible y hubo de echarse el resto, como suele decirse.
Al certamen de Madrid concurrieron numerosos sabios extranjeros
(Behring, Metchnikoff, Waldeyer, Frank, Veratti, van Gehuchten,
Henschen, Unna, Donaggio, etc.) y no pocos médicos nacionales é
hispano-americanos.
Encargado de la presidencia de la _Sección de Anatomía y
Antropología_, tuve harto trabajo, durante aquellos días de
incesante ajetreo, con organizar y dirigir las sesiones, ultimar
las comunicaciones de los discípulos y mías, disponer veladas
de demostraciones microscópicas, concurrir á banquetes y otros
festejos oficiales, etc. Procuramos todos, en fin, hacer grata á los
forasteros ilustres la estancia entre nosotros.
Entre los congresistas eminentes que tomaron parte en los trabajos
de mi sección, merecen mención especial, no sólo por su renombre
mundial, sino por el interés de sus comunicaciones, Mr. Henschen,
profesor de Estocolmo, que disertó, en una de las cátedras de San
Carlos, sobre casos clínicos de _ceguera mental_ y las lesiones
concomitantes del lóbulo occipital (tema íntimamente relacionado
con mis estudios histológicos acerca de _la fisura calcarina_); el
profesor Unna, de Hamburgo, dermatólogo insigne, creador de notables
métodos de coloración de los tejidos epitelial y conjuntivo, el cual
en brillante conferencia pública tuvo la galantería de atribuirme
la prioridad del descubrimiento de las _células del plasma_ (mis
_corpúsculos cianófilos_ hallados en los _sifilomas_); el maestro
de Lovaina Mr. A. van Gehuchten, antiguo amigo, que presentó al
Congreso las primicias de cierto proceder de demostración del
trayecto de las raíces motrices (proceder de la _degeneración
retrógrada tardía_); el Dr. E. Veratti, joven de mucho talento,
discípulo y ayudante de Golgi, de cuyas ideas y métodos se confesó
en varias notas y discusiones entusiasta defensor; el joven profesor
de Módena A. Donaggio, que impresionó agradablemente en las sesiones
demostrativas, exhibiendo bellísimas preparaciones del _armazón
interior_ de las neuronas (las _neurofibrillas_ de Bethe) coloreado
mediante técnica de su invención, que no creyó prudente divulgar;
y, en fin, otros varios concurrentes distinguidos de que no guardo
memoria.
Entre los congresistas españoles --aludo, naturalmente, á la
_Sección anatómica y antropológica_-- merecen mención especial:
el profesor Antón, que pronunció elocuente conferencia acerca de
algunos problemas antropológicos; y muy señaladamente el Dr. L.
Simarro, quien en presencia de numerosos sabios extranjeros mostró,
en el _Laboratorio de Investigaciones biológicas_, magníficas
preparaciones de la red neurofibrillar impregnadas con un método
original de que trataremos ulteriormente. De menos interés fueron
las comunicaciones presentadas por otros congresistas, incluyendo
las mías, una de las cuales[204], de índole polémica, versó sobre
las aventuradas _teorías reticularistas_ de A. Bethe (cuyo método
acababa yo de ensayar). Con ella me propuse, sobre todo, promover y
animar la disensión sobre el importante problema de las conexiones
interneuronales y la fina estructura del protoplasma nervioso,
cuestiones por entonces de palpitante actualidad.
[204] _Cajal_: Consideraciones críticas sobre la teoría de Bethe
acerca de la estructura y conexiones de las células nerviosas.
_Trab. del Lab. de invest. biol._, tomo II, 1903. (Con 8 figuras).
En esta comunicación se exponen (y los trabajos posteriores de
numerosos sabios nos han dado la razón) dos asertos críticos de
cierto interés, á saber:
_a_) Que, dadas las conexiones reales y la morfología de las
neuronas, las _neurofibrillas_ no pueden ser estimadas, según
piensan Bethe y Apáthy, como la única substancia conductriz del
protoplasma nervioso.
_b_) Que el método de Bethe, por no colorear las arborizaciones
pericelulares y colaterales nerviosas, es improcedente para el
estudio de las conexiones interneuronales.
En las sesiones de demostración exhibí muchas preparaciones
escogidas, concernientes á la estructura de la médula espinal,
cerebro y cerebelo; preparaciones teñidas concordantemente por los
dos métodos de Golgi y Ehrlich (cestas nerviosas pericelulares,
colaterales y bifurcaciones nerviosas, etc.) á fin de persuadir á
los congresistas de la absoluta objetividad de mis interpretaciones
referentes al modo de terminar las fibras nerviosas en la substancia
gris.
En fin, para ser completo, por lo que hace á mi personal intervención
en dicho certamen, mencionaré todavía mi conferencia, pronunciada en
el gran anfiteatro de San Carlos con asistencia de numerosos sabios
extranjeros, y honrada, además, con la presencia del Presidente del
Consejo de Ministros, Sr. Fernández Villaverde. Versó mi lección
sobre el _plan estructural del tálamo óptico_[205].
[205] _Cajal_: Plan de estructura del tálamo óptico. Conferencia
dada en la Facultad de Medicina de Madrid el 28 de Abril de
1903 con ocasión del _Congreso médico internacional_. Madrid,
1903. (Con 5 esquemas, copias de las tablas murales dibujadas al
efecto).
Contiene este trabajo una síntesis de nuestros estudios sobre el
tálamo con la interpretación fisiológica general de los nuevos
hallazgos.
Entre otros conceptos, se afirma que el tálamo encierra dos
órdenes de focos nerviosos ó estaciones intermediarias: los
focos _motores centrífugos_ residentes, por lo común, en el
plano inferior (_cuerpo de Luys_, _substancia nigra_, etc.), que
reciben colaterales de la vía piramidal y cuerpo estriado; y los
focos _sensoriales centrípetos_, situados en el piso superior y
en relación con las vías sensitivas ó sensoriales aferentes, etc.
El segundo acontecimiento aludido no puede referirse sin retroceder
algo en el curso del tiempo y exponer algunos antecedentes técnicos.
Notorio es que, en ciencia como en arte, cada época tiene su
preocupación dominante, á la cual pocos logran sustraerse. Ultimado,
ó al menos notablemente impulsado el conocimiento de la morfología
neuronal y del comportamiento genérico de los apéndices axónicos
y dendríticos, la mirada de la mayoría de los neurólogos volvióse
hacia la íntima estructura del protoplasma nervioso. Al par de otros
observadores, yo fuí también arrastrado por la corriente.
Ciertamente, el problema estructural y la solución propuesta por
los años de 1900 á 1903 eran cosas viejas. Desde hacía muchos
lustros, Max Schutze, Schwalbe, Ranvier, y, en más recientes
tiempos, A. Dogiel (1898), hubieron de percibir, dentro del cuerpo
de las células nerviosas, cierta enigmática urdimbre compuesta
de finas y granulosas hebras, prolongadas hasta las expansiones
protoplásmicas. Pero los métodos de la época eran insuficientes para
esclarecer satisfactoriamente el comportamiento de dicho esqueleto
intraprotoplásmico. Semejantes sutilísimos filamentos, ¿constituyen
red ó marchan independientes? ¿Prolónganse dentro de los axones hasta
las arborizaciones terminales mismas? En fin, ¿existen motivos para
estimarlos como vías intracelulares, especialmente diferenciadas para
la propagación del impulso nervioso?
La respuesta definitiva á estas preguntas implicaba inexcusablemente
el encuentro de algún proceder de teñido intensamente selectivo del
referido esqueleto. Con relación á las células nerviosas de algunos
invertebrados (_hirudo_, _pontobdella_, etc.), un sabio húngaro, Mr.
Apáthy[206], de Clausenburg, tuvo la fortuna de tropezar (1897) con
este ansiado recurso analítico (fórmula especial de fijación asociada
al cloruro de oro) y de percibir y demostrar por primera vez, intensa
y vigorosamente teñidas en violado, las consabidas _neurofibrillas_
ó _fibrillas elementales conductrices_. Intensa emoción produjeron
las bellísimas preparaciones mostradas por dicho sabio en diversos
Congresos. Todos creímos que al fin se había esclarecido el enigma de
la fina estructura neuronal.
[206] _S. Apáthy_: Das leitende Element der Nervensystems und
seine topographischen Beziehungen zu den Zellen. _Mittheil. a. d.
Zool. Station zu Neapel._ Bd. 12. H. 4, 1897.
Desgraciadamente, el método complicadísimo imaginado por Apáthy no
era aplicable á los vertebrados. Su inconstancia, además, dejaba
tamañitas las fórmulas más azarosas de la técnica histológica.
Cuantos neurólogos lo emplearon, fracasaron lamentablemente.
Y cuando ya, en descenso la ola del entusiasmo, pensábase que
aquellas elegantes redes intracelulares eran quizá algo privativo
de los vermes, apareció en el palenque otro investigador de grandes
arrestos. Fué el fisiólogo A. Bethe[207], á la sazón profesor de
Strasburgo, quien puso la cuestión nuevamente á la orden del día,
sorprendiéndonos con importante Memoria, donde, auxiliado por un
método especial (combinación de un mordiente, el _molibdato amónico_,
con un colorante, el _azul de toluidina_), demostró las fibrillas ó
_neurofibrillas_ de los vertebrados, señaladamente las contenidas
en las voluminosas células de la médula, ganglios, cerebelo, etc.
Fascinados por la importancia y novedad de las revelaciones de Bethe,
todos quisimos colaborar en la empresa, esperanzados de nuevas y
estupendas conquistas.
[207] _A. Bethe_: Ueber die Neurofibrillen u. der Ganglienzellen
von Wirbelthieren und Beziehungen zu Golginetzen. _Arch. f.
mikros. Anat._, etc. Bd. 55, 1900.
Mas el sino adverso continuaba influyendo. El enrevesado proceder de
A. Bethe no estaba al alcance de todo el mundo. Como el de Apáthy,
sólo floreció en el Laboratorio de su autor ó en las manos de
poquísimos iniciados. En cuanto á mí, logré á fuerza de paciencia
algunas mediocres é insuficientes coloraciones. Y atribuyendo
el fiasco á la impericia del principiante, demandé cortésmente
al ingenioso creador del método alguna preparación típica para
confrontarla con las mías.
Semanas después recibía, cuidadosamente embaladas, cual objeto
precioso, dos preparaciones: una, del cerebelo; otra, de la médula
espinal del conejo.
--Estos preparados son excepcionalmente buenos --escribíame el
profesor de Strasburgo--. Han sido ejecutados por el más aventajado
de mis discípulos. Ponga usted cuidado en su manejo y devuélvamelos
lo antes posible, porque no dispongo de otros por ahora.
¡Oh decepción!... ¡Las joyas técnicas, aquellos preparados
inestimables desembalados con emoción y examinados con el corazón
palpitante, no sobrepujaban á los míos!... Ciertamente, dentro del
protoplasma nervioso advertíanse las neurofibrillas impregnadas
de violado; pero tan pálidas en el seno granuloso de la ganga
del citoplasma, que resultaba imposible reconocer netamente
su disposición real y sus conexiones con las demás texturas
extracelulares. ¡Y sobre tales imágenes había construído Bethe
formidable edificio teórico! En vano me afanaba en buscar el trayecto
exterior de tan sutiles filamentos. Sin embargo de lo cual, el sabio
de Strasburgo nos hablaba, con sorprendente aplomo, del enlace
substancial de aquéllos con la red pericelular de Golgi, red á su vez
caprichosamente interpretada (con olvido ó menosprecio de todas las
terminantes revelaciones de los métodos de Golgi y Ehrlich) como la
porción terminal de las fibras nerviosas. Á la verdad, poco exigente
se mostraba el fisiólogo alemán en cuanto al objetivismo de los datos
sobre que asentar magnas conclusiones.
Ardía yo en deseos de contemplar las susodichas neurofibrillas
en preparaciones irreprochables. Desilusionado de las técnicas
aleatorias é insuficientes de Apáthy y Bethe; imposibilitado, además,
de ensayar la de Donaggio, conservada en secreto, y persuadido,
en fin, de que para la coloración vigorosa de tan sutiles hebras
era inexcusable recurrir á las reducciones metálicas, entreguéme
porfiadamente, desde 1901, á numerosos ensayos de impregnación;
aprovechando unas veces la reacción del _óxido de plata amoniacal_,
descubierta por Fajersztajn (1901); otras, la del cloruro de oro en
presencia del _tanino y del ácido pirogálico_; algunas, en fin, las
_sales haloides_ de plata y los reductores fotográficos introducidos
en la técnica por Simarro (1900). Fruto inicial, aunque poco
importante, de aquella obstinada labor, fueron ciertas fórmulas
de coloración de los cilindros-ejes y de la mielina[208]. Pero el
esqueleto neurofibrillar y las terminaciones nerviosas centrales,
objetivo principal de mis afanes, resistíanse obstinadamente.
[208] _Cajal_: Pequeñas comunicaciones técnicas, etc. _Revista
trimestral micrográfica_, Tomo V, 1900.
Á tan empeñadas probaturas incitábame, no tanto la esperanza de topar
con un proceder fácil de demostración de la urdimbre intraneuronal,
cuanto el ansia de descubrir fórmula de impregnación susceptible
de provocar coloraciones intensas, al par que _perfectamente
transparentes_, de las células y fibras nerviosas. Anhelaba
contrastar una vez más las bellas revelaciones del cromato de plata
con las de otro recurso al que no pudiera reprocharse el defecto
de traducir el soma celular y sus expansiones en siluetas opacas,
sin vislumbre de estructura. En fin, me ilusionaba la esperanza de
procurarme un arma poderosa que esgrimir contra muchos novadores
técnicos, inclinados irresistiblemente al vicio anárquico de negar,
en nombre de una nueva verdad, las verdades descubiertas por otros.
Después de infructuosas tentativas con las técnicas precedentes,
consagré en 1903 particular atención al método del Dr. Simarro[209],
primer autor que logró teñir las neurofibrillas mediante las sales de
plata.
[209] _L. Simarro_: Nuevo método histológico de impregnación
por las sales fotográficas de plata. _Revista trimestral
micrográfica_, tomo V, 1900.
Consta la técnica del ilustre neurólogo español de seis
operaciones esenciales: 1.ª Envenenamiento de los animales,
durante varios días, con dosis crecientes de bromuro ó de yoduro
de potasio. 2.ª Inmersión por varios días (dos á diez) de trozos
de médula espinal en solución al 1 por 100 de nitrato de plata,
al objeto de provocar en los tejidos la formación de _yoduro_ ó
_bromuro argénticos_ ú otras combinaciones argéntico-orgánicas.
Cuando los animales no son envenenados, el nitrato sólo produce,
naturalmente, cloruro y albuminatos argénticos. 3.ª Induración
rápida de las piezas en alcohol é inclusión subsiguiente en
celoidina para efectuar secciones microtómicas, operaciones que
se practican en la obscuridad. 4.ª Exposición de los cortes á la
luz como si fueran papeles fotográficos. 5.ª Revelación de las
secciones en el cuarto obscuro, mediante un reductor fotográfico,
por ejemplo: el ácido pirogálico, la hidroquinona, etc.,
adicionados de sulfito sódico y de un álcali enérgico. En fin,
fijado en hiposulfito de sosa.
El haloide argéntico (bromuro, yoduro ó simplemente el cloruro),
seleccionado por las células y fibras nerviosas, conviértese
por reducción en depósito metálico finísimo, de matiz pardo ó
rojo. Según el autor del método, las neurofibrillas aparecerían
solamente en las piezas _bromuradas_ ó _yoduradas_. En las
simplemente cloruradas parece no haberlas visto.
Por desgracia, y por lo que toca á la presentación de las
neurofibrillas, el ingenioso método del sabio español dista mucho
de ser constante. Y, cuando por raro caso, lógranse resultados
excelentes, el depósito argéntico escoge de manera casi exclusiva
el armazón de las grandes y medianas células de la médula espinal
y bulbo raquídeo. Imposible obtener coloraciones neurofibrillares
en el cerebro, cerebelo, ganglios y terminaciones nerviosas.
Los axones mismos imprégnanse con gran irregularidad. Mis
primeras tentativas, pues, siguiendo la técnica puntualizada
por el Dr. Simarro, fueron poco afortunadas. Estábamos, al
parecer, condenados á no disponer jamás de un recurso analítico
constante y general para el teñido del esqueleto neurofibrillar.
Recuérdense los azarosísimos resultados de las técnicas de Apáthy
y Bethe.
Antes de abandonar dicho método, resolví analizarlo
escrupulosamente, variando sus momentos operatorios y
determinando, si ello era posible, las causas de su desalentadora
inconstancia. Á este propósito, comencé por modificar una de las
condiciones, ó sea el envenenamiento de los animales. En vez de
yoduros y bromuros, usé diversas sales metálicas, sólo venenosas
á dosis casi masivas (ferrocianuro de potasio, ferricianuro,
sulfato de cobre, etc.); varié metódicamente el tiempo de
permanencia de las piezas en la estufa, así como la proporción
del nitrato de plata; prescindí de la acción de la luz y de los
reveladores alcalinos, usando los llamados por tratadistas de
fotografía _reductores físicos_, etc.
De este esmerado análisis experimental obtuve ya tres enseñanzas
valiosas. 1.º Que la coloración neurofibrillar no tiene nada que
ver con el envenenamiento de los animales, puesto que se obtiene
lo mismo en los envenenados con sales de cobre y hierro que en
los no intoxicados. 2.º Que se precisa el concurso del calor, no
bastando la inmersión de las piezas en el nitrato de plata, por
veinticuatro ó cuarenta y ocho horas, sino el uso de la estufa á
37° durante cuatro días, ó con temperatura del verano (22° á 27°)
por ocho ó nueve. (Esta influencia del calor fué ya sospechada,
aunque no precisada, por Simarro, cuando mentaba la _madurez de
la emulsión_ de bromuros y yoduros). 3.º Que, en fin, en las
preparaciones de Simarro (solarizadas y reveladas como placas
fotográficas) existen entremezcladas perjudicándose mutuamente,
dos reacciones, de naturaleza diferente: una constante, y poco
instructiva, la provocada por la luz sobre cloruros y demás
combinaciones argentico-protéicas (teñido en negro granuloso
ó pardo de las _estrangulaciones de Ranvier_, _estrías de
Fromman_, coloración parcial de los _gruesos axones_, etc.);
y otra eventual, afotogénica, muy instructiva, consistente en
la impregnación en tono rojo ó café de las neurofibrillas y
nucleolos y motivada probablemente por el depósito selectivo de
plata coloidal.
Pero si los yoduros y bromuros impresionados por la luz no
concurren á la _reacción neurofibrillar_, ¿cuál es la combinación
argéntica eficaz? ¿Será el cloruro de plata? Ello parecía
improbable, porque los cloruros, en presencia de los reductores
alcalinos, no generan plata coloidal, sino precipitaciones
groseras. ¿Cuál es, pues, esta materia enigmática y en qué
condiciones se produce?
Todos estos ensayos é inducciones produjeron un solo efecto:
simplificar la técnica del sabio español, descartando la enfadosa
operación del envenenamiento de los animales y evitando la acción
perturbadora de la luz. Mas, á pesar de todo, malográronse mis
esperanzas de prestar á la coloración neurofibrillar constancia,
vigor y generalidad. Comparables en principio con las de Simarro, mis
preparaciones no decían nada nuevo.
Por entonces (Agosto de 1903) y á guisa de sedante del cerebro
sobreexcitado, emprendí el citado viaje de placer por la seductora
Italia. Aquellas nobles y excelsas visiones de arte causáronme vivo
deleite; pero, de vez en cuando retornaban, distrayéndome de mis
contemplaciones, inquietudes de Laboratorio. Ante los cuadros de
un Museo ó al pie de ruinas gloriosas, acometíanme obsesionantes
hipótesis necesitadas de contraste experimental, proyectos técnicos,
al parecer, henchidos de promesas.
Cierto día, ya iniciado el viaje de regreso y vibrante el cerebro por
el recio trepidar del tren, apoderóse de mí, con el imperio de idea
fija, cierta sencillísima hipótesis que explicaba satisfactoriamente
las irregularidades del método de Simarro y encerraba en germen,
caso de confirmarse, un recurso analítico tan simple como eficaz.
Hoy no acierto á comprender cómo tan trivial pensamiento tardó tanto
en ocurrírseme. ¡Cuánta verdad es que las más sencillas soluciones
acuden siempre las últimas y que la imaginación constructiva, antes
de hallar el buen camino, la ansiada _fórmula económica_ que diría
Mach, comienza por perderse en lo complicado!...
He aquí la idea elemental y fecunda que tanto coqueteó antes de
entregarse: _La substancia enigmática generadora de la reacción
neurofibrillar, debe de ser pura y sencillamente el nitrato de plata
caliente incorporado á los coloides del protoplasma y susceptible
de precipitarse en estado coloidal y en virtud de procesos físicos
sobre el esqueleto neurofibrillar._ Cosa rara, una vez surgida en
mi mente, la citada concepción se me presentó como verdad inconcusa
y necesaria. Ni por un momento recelé que el laboratorio pudiera
desmentirme.
Es que la hipótesis explicaba llana y satisfactoriamente todos los
hechos contradictorios y resolvía todas las dificultades prácticas.
Por ejemplo: lo irregular y caprichoso de la reacción neurofibrillar,
en el proceder de Simarro, comprendíase bien, recordando que el
alcohol primero, la mezcla de éter y alcohol después, la celoidina
más tarde, y en fin, los baños reveladores, sustraían casi del todo
el _nitrato de plata indispensable á la reacción_, sólo retenido de
vez en cuando y accidentalmente por el cuerpo de las neuronas más
voluminosas, ó por los cortes notablemente espesos. Pero lo mejor de
la susodicha hipótesis consistía en que señalaba comodísimo remedio á
las mencionadas irregularidades del teñido. Todo se reducía á reponer
en los cortes el nitrato de plata perdido, ó mejor aún, reducir
en masa las piezas recién sacadas del nitrato, evitando la acción
perturbadora del alcohol y la influencia acaso nociva también de la
luz[210].
[210] Con las reflexiones y conjeturas precedentes no pretendo
sentar doctrina definitiva acerca del mecanismo íntimo de
la reacción neurofibrillar, que, aun hoy y á pesar de los
penetrantes análisis quimico-físicos de Liesegang, permanece en
gran parte enigmática. Me limito solamente á señalar el camino
seguido por mi pensamiento hasta caer, más ó menos casualmente,
en la nueva fórmula de impregnación.
Por lo demás, mi concepción acerca del íntimo mecanismo de la
coloración neurofibrillar en los procederes de Simarro y mío,
ha sufrido variaciones al compás de las nuevas investigaciones
técnicas. Al principio, creí que había perfeccionado
decisivamente el método del sabio español, ó dicho más
exactamente, sacado á luz y desarrollado un germen fecundo, casi
ahogado por otras reacciones poco útiles y aun perjudiciales
(las acciones fotogénicas sobre los haloides argénticos). Pero,
después, caí en la cuenta de que el proceso de la coloración
es muy complicado, entrando en él principios de orden físico,
por entonces indeterminables. Á corregir mi juicio, contribuyó
el reconocer que era imposible conseguir en los cortes una
coloración neurofibrillar comparable, ni aun de lejos, con las
logradas sobre los bloques nerviosos, no obstante adicionar á
las secciones del método de Simarro la sal argéntica perdida,
ó seccionar las piezas, recién extraídas del baño argéntico,
mediante el microtomo de congelación. Sin duda actúan en el
proceso fenómenos de atracción selectiva entre los _gel_ de
las neuronas, de una parte, y los corpúsculos ambientes de
plata coloidal; atracciones sólo posibles, ó sólo prácticamente
vigorosas, al abrigo del aire y en el seno de gruesas masas
nerviosas formadas de proteínas en estado coloide.
Parecida opinión, con desarrollos y puntos de vista interesantes
que no puedo detallar aquí, sostiene Liesegang, gran autoridad
en fotoquímica, quien ha consagrado dos profundos análisis
al mecanismo físico de acción de mi fórmula de impregnación.
En tales estudios, además de demostrar palmariamente que el
principio de mi proceder nada tiene de común con el de la
reacción de Simarro, expone cierta luminosa hipótesis sobre
la acción de los que él llama _gérmenes de reducción_. Con el
concurso de los fijadores, ciertas substancias reductrices
residentes en el protoplasma nervioso, formarían, á expensas
del nitrato de plata ambiente, gérmenes infinitesimales de
plata reducida, los cuales atraerían vivamente el metal
coloidal producido por la acción del revelador. Véanse los
notables trabajos de Liesegang, singularmente el titulado:
Die Kolloidchemie der histologischen Silberfärbungen.
_Sonderabdruck der Kolloidchemische Beiheften._ Bd. III. Dresden,
1911.
Dejo dicho que la precedente hipótesis perseguíame como una obsesión.
Devorábame la impaciencia. Y ansiaba hallarme en el Laboratorio para
poner en práctica mis proyectos. Génova, Niza, Mónaco, Marsella,
todas las rientes y luminosas ciudades de la prestigiosa _Côte
d’azur_ desfilaron por mi retina sin dejar huella apenas en mi
espíritu.
Á mi llegada á Madrid caí sobre los animales de experimentación
guardados en mi Laboratorio como el león sobre su presa. Varios
eran mis proyectos, no todos viables, según se vió después. Contra
mis previsiones, la adición de nitrato de plata á los cortes del
método de Simarro (después de la celoidina, etc.) no mejoró nada
los resultados[211]. En cambio, los dió excelentes otro de mis
proyectos, encaminado á reforzar y retener el nitrato de plata
libre de las piezas, á saber: _a_, inmersión directa de los trozos
nerviosos en nitrato de plata; _b_, estufa cuatro días; _c_,
reducción, en bloque y en la obscuridad, de la sal argéntica mediante
baño de ácido pirogálico, con ó sin adición de formol; _d_, lavado;
_e_, alcohol; encastramiento en celoidina y, en fin, secciones
microtómicas.
[211] Aun hoy, no obstante reiterados ensayos, no he conseguido
teñir regularmente las neurofibrillas en las secciones,
cualquiera que sea el fijador empleado, á menos de recurrir, á
la fórmula de Bielschowsky. Modernamente, ha indicado Liesegang
un medio --adición de un coloide (solución espesa de goma, por
ejemplo) al reductor físico-- con el cual se obtienen algunos
resultados, aunque de ningún modo comparables á los conseguidos
según el _modus operandi_ común.
Como se ve, en lugar del _desarrollo químico_ usado por Simarro,
susceptible de actuar solamente sobre las sales haloides argénticas,
previa acción de la luz, yo me serví de un _reductor físico_ (según
el lenguaje de los tratadistas de fotografía) incapaz de ennegrecer
los cloruros, pero capaz de provocar en el seno de las neuronas la
formación de plata coloidal naciente.
Grandes fueron mi emoción y sorpresa. Desde los primeros ensayos,
las neurofibrillas de casi todas las células nerviosas de la médula,
bulbo, ganglios, cerebro y cerebelo, sin contar numerosos tipos de
arborizaciones axónicas terminales, aparecieron espléndidamente
impregnadas con matiz pardo, negro ó rojo ladrillo, perfectamente
transparente. Muchas dendritas perseguíanse á placer al través de
la enmarañada urdimbre de la substancia gris, gracias al intenso
tono pardo obscuro de sus hacecillos neurofibrillares. Según era
de prever, la inoportuna reducción de cloruros y albuminatos
argénticos (_estrías de Fromman_, _estrangulaciones_, etc.) brillaba
por su ausencia. En fin, y ésta era la más valiosa ventaja, dicha
coloración, además de lograrse en todos los centros nerviosos,
resultaba absolutamente constante á condición de ajustarse
severamente á mi formulario.
Recuerdo todavía la exclamación admirativa con que, semanas después
del hallazgo, recién publicada una nota explicativa de la fórmula, me
participaba van Gehuchten el resultado de su primer ensayo sobre el
cerebro del conejo. «Je n’ai pas dormi!» Tampoco yo dormí en varios
días, vibrante el cerebro con la concepción de nuevos planes de
trabajo y afanado además con la ingrata tarea de precisar, á fuerza
de experimentos, las condiciones óptimas de la reacción.
Cierta nota preventiva precipitadamente redactada[212] para unos
_Archivos médicos_, recientemente fundados por el Dr. Cortezo y el
Dr. Pittaluga, completada después por extensa y reposada monografía
cuajada de grabados[213], divulgaron rápidamente los resultados
obtenidos, que fueron confirmados y ampliados notablemente por
multitud de sabios extranjeros. Entre los confirmadores de la primera
hora, á quienes el método rindió pingüe cosecha de hechos nuevos,
recordamos á van der Stricht, van Gehuchten, Michotte, Besta,
Azoulay, Nageotte, Lugaro, Holmgren, Retzius, v. Lenhossék, Schäffer,
Humberto Rossi, Ottorino Rossi, Levi, Pighini, Legendre, Medea,
Perroncito, London, G. Sala, etc., etc.
[212] _Cajal_: Sobre un sencillo procedimiento de impregnación
de las fibrillas interiores del protoplasma nervioso. _Archivos
latinos de Medicina y Cirugía_, núm. 20, Octubre de 1903.
[213] _Cajal_: Un sencillo método de coloración del retículo
protoplásmico y sus efectos en diversos centros nerviosos. _Trab.
del Lab. de Invest. biol._, 1903. (Con 38 grabados).
De este trabajo salió á luz, en forma de libro, una traducción
francesa del Dr. Azoulay, con algunas adiciones importantes.
Con singular fortuna aplicaron en España la nueva fórmula mi
hermano, R. Illera, Dalmacio García y muy singularmente mi ayudante
el Dr. Tello[214], quien en la exploración á que sometió los centros
de los vertebrados inferiores, á más de recoger copiosa cosecha
de hechos nuevos, descubrió el curioso fenómeno de la alteración
neurofibrillar por invernación (_transformación fusiforme_, etc.).
[214] _Tello_: Sobre la existencia de neurofibrillas colosales en
las neuronas de los reptiles. _Trab. del Lab. de Invest. biol._,
tomo II, Diciembre de 1903.
_Idem_: Las neurofibrillas en los vertebrados inferiores. _Trab.
del Lab. de Invest. biol._, tomo III, 1904.
No obstante sus excelencias y su capacidad de revelar el retículo
hasta en los más pequeños elementos del cerebro y cerebelo, el método
adolecía aún de algunas lagunas. El nitrato de plata posee mediana
aptitud fijadora, y el _modus operandi_ primeramente adoptado tiñe
muy á menudo pálida y desigualmente los axones. Pero, haciendo
preceder la nitratación argéntica de las piezas de un fijado, por
veinticuatro horas, en alcohol sólo, en formol y mejor aún en el
alcohol adicionado de algunas gotas de amoníaco, corrígese tan
grave defecto, lográndose coloraciones enérgicas y regulares de
los cilindros-ejes gruesos y finos, así como de la mayoría de las
arborizaciones nerviosas centrales y periféricas. Esta nueva fórmula
tiene, además, la ventaja de ser aplicable á todos los vertebrados y
de producir imágenes excelentes en los animales recién nacidos ó en
fase embrionaria.[215]
[215] _Cajal_: Algunos métodos de coloración de los
cilindros-ejes, neurofibrillas y nidos nerviosos. _Trab. del Lab.
de Invest. biol._, tomo III, 1904.
He aquí la fórmula definitiva:
1.º Fijación de las piezas en alcohol amoniacal. (Para 50
centímetros cúbicos de alcohol de 40° añadíanse 5 á 10 gotas de
amoníaco).
2.º Inmersión de las mismas, durante cinco á seis días, en
nitrato de plata al 3 por 100 (ó al 1 ½, según los casos)
conservado en estufa á 37° y en la obscuridad durante cuatro á
seis días.
3.º Después de lavado superficial de los trozos nerviosos,
reducción por veinticuatro horas, también en la obscuridad ó
bajo luz tenue, en el siguiente reductor físico (incapaz de
desarrollar los cloruros): ácido pirogálico, 1; agua, 90; formol,
10.
4.º Lavado rápido de las piezas que se induran en alcohol. En
fin, celoidina y secciones microtómicas.
Más adelante aconsejamos todavía otras fórmulas, simples
variantes de la anterior, con aplicación á casos especiales.
Confío en que perdonará el lector los prolijos detalles expuestos
sobre las indagaciones metodológicas de 1903. Pero el asunto
justifica la extensión. Sobre que la nueva técnica fué la señal
de larga serie de trabajos de laboratorio publicados durante
ocho ó diez años, al escribir estos recuerdos no puedo olvidar
que soy preferentemente leído por aficionados á las tareas del
Laboratorio. Ellos sabrán disculparme y acaso agradecerme ciertas
minucias descriptivas. Creo, además, que nada anima tanto al novel
investigador como la narración sincera de las tentativas practicadas,
de las sinuosidades y extravíos de la labor experimental, en fin, de
los ardides puestos en juego durante el largo proceso inquisitivo
hasta alcanzar la solución anhelada; verá que aun las más infelices
conjeturas contienen á veces gérmenes de acción provechosa y suelen
recordar las hazañas del Cid, ganando batallas después de muerto;
observará, en fin, que el éxito representa casi siempre función y
premio de la atención ahincada y del trabajo perseverante. Cuando
sepa hasta qué punto influye el azar --el azar bien aprovechado,
naturalmente-- en los venturosos hallazgos, repetirá sin duda, lleno
de orgullosa confianza, la conocida exclamación de Corregio ante un
cuadro de Rafael «_Anch’ io son’ pittore_».
En el caso mencionado el fruto logrado debióse enteramente
al esfuerzo analítico insistente y á infatigable paciencia.
Naturalmente, conforme suele ocurrir con todas las invenciones,
mi modesto hallazgo partió de los hechos experimentales señalados
por mis antecesores: de los ensayos de Fajersztajn[216], que me
proporcionaron el uso del formol como coadyuvante reductor del
ácido pirogálico; de la fórmula colorante de Bethe, de quien tomé
el líquido fijador (alcohol amoniacal) y, sobre todo, del proceder
fotográfico de Simarro, punto de partida de mis investigaciones, y
á cuyo autor se deben estos dos progresos cardinales: haber probado
el primero la posibilidad de teñir las neurofibrillas con los
compuestos argénticos y haber introducido en la técnica histológica
los reductores fotográficos.
[216] _Fajersztajn_: Ein neues Silberimpregnationverfahren als
Mittel zur Färbung der Axencylinder. _Neurol. Centralbl._, núm.
3, 1.º Febr. 1901.
Singular coincidencia. Poco después de publicada mi fórmula,
obtenida, según dejo dicho mediante el análisis experimental de
la reacción de Simarro, el alemán Bielschowsky[217] arribaba á
parecidos resultados, sirviéndose también del nitrato de plata,
pero tomando como punto de partida el método de Fajersztajn. En
adelante, la técnica neurológica contó, pues, con dos recursos
analíticos, igualmente fáciles y fecundos: el de Bielschowsky,
especialmente aplicable al encéfalo humano y señaladamente á sus
lesiones anatomo-patológicas, y el mío, singularmente apropiado
para la exploración estructural de los centros nerviosos de los
mamíferos y vertebrados inferiores, ganglios sensitivos y simpáticos,
terminaciones nerviosas y desarrollo embrionario.
[217] _Bielschowsky_: Die Silberimpregnation der Neurofibrillen.
_Neurol. Centralbl._ H. 22, 1.º Nov. 1903.
[Ilustración]