Die mit Hansens Hämatoxylin ~über~färbten (30 Minuten) Schnitte kommen
aus dem destill. Wasser
a) in 5 ccm Pikrofuchsin (Nr. 54, S. 9) 1-3 Minuten,
b) in 5 ccm destilliertes Wasser 10-30 Sekunden,
c) in 5 ccm Alkohol 90% 1 Minute,
dann Einschluß in Xylolbalsam nach § 10,3 (S. 45).
Der beim Einschluß nach § 10,3 nötige Aufenthalt in absol.
Alkohol darf hier höchstens 2 Minuten dauern.
Resultat: Bindegewebe leuchtend rot, elastisches Gewebe, Muskelfasern
gelb, Epithel und Kerne braun.
Die Methode ist nur bei ~feinen~ Schnitten anzuwenden und gelingt am
besten nach Alkohol- oder Sublimatfixation, weniger, aber auch noch
genügend, nach Fixierung in Lösungen, die Chromsäure bzw. ihre Salze
enthalten. Auch ist die Haltbarkeit der Färbung eine beschränkte.
Letzterem Mißstande kann man durch Ansäuerung (Einlegen der Schnitte
vor a) und nach b) in 5 ccm salzsaurem Alkohol [S. 9, 42] auf je eine
Minute) entgegenwirken.
19. »~Dreifachfärbung~«. Die Schnitte werden in Delafield-Hämatoxylin
gefärbt (5 S. 35), kommen aus dem Wasser
a) in Saffranin (S. 9) 5 Minuten,
dann b) in Alkohol abs. 5 "
dann c) in neuen Alkohol absol. 5 "
dann d) in neuen Alkohol absol. 5 "
dann e) in den verdünnten Pikrinalkohol (17a S. 42) 1 Minute,
dann f) in reinen Alkohol absol. 1/2 "
dann Einschluß nach § 10,3 (S. 45).
Resultat: Schleim blau, Kerne rot, Protoplasma, Fasern gelb. Besonders
schön nach Fixierung mit Chrom-Osmium-Essigsäure.
§ 9. Injizieren.
Das Füllen der Blut- und Lymphgefäße mit farbigen Massen ist eine
besondere Kunst, die nur durch sehr viel Übung erworben werden kann.
Die Kenntnis der vielen kleinen, hier zur Anwendung gelangenden
Kunstgriffe läßt sich kaum durch die Lektüre selbst in aller Breite
gegebener Anweisungen aneignen. Hier ist der praktische Unterricht
unerläßlich. Dementsprechend glaube ich in dem für Anfänger bestimmten
Buche auf die Angabe einer ausführlichen Injektionstechnik verzichten
zu müssen.
Wer sich im Injizieren versuchen will, muß eine gut schließende,
mit leicht beweglichem Stempel versehene Spritze und Kanülen von
verschiedener Dicke haben. Als Injektionsmasse empfehle ich:
Berlinerblau von ~Hollborn~ (Adr. S. 3) 3 g in 600 ccm destilliertem
Wasser gelöst.
(Siehe auch ~Tandler~, Zeitschrift für wissenschaftl. Mikroskopie
Bd. XVIII. 1901. S. 22.)
Man beginne mit der Injektion einzelner Organe, z. B. der Leber, welche
den Vorzug hat, daß selbst eine unvollkommene Füllung ihrer Gefäße noch
brauchbare Resultate ergibt. Das injizierte Objekt fixiere man 2-4
Wochen in Müllerscher Flüssigkeit (S. 15) und härte es in allmählich
verstärktem Alkohol (S. 17). Die Schnitte dürfen nicht zu dünn sein.
Für Lymphgefäß-Injektion ist chinesische Tusche (siehe ~Lendorf~,
Anatom. Hefte Bd. 17, S. 370) und die Methode von ~Polano~ (Deutsche
med. Wochenschrift 1902, Nr. 27) zu empfehlen.
§ 10. Einschließen und Konservieren der Präparate.
Die fertigen Schnitte usw. werden nun zur mikroskopischen Untersuchung
auf einen Objektträger übertragen und mit einem Deckglase bedeckt.
Die Medien, in welchen sich die Schnitte befinden, sind entweder 1.
~Wasser~, oder, wenn man die Schnitte ~aufhellen~ und ~konservieren~
will, 2. ~Glyzerin~ oder 3. ~Xylolbalsam~.
Das ~Übertragen~ auf den ~Objektträger~ geschieht so, daß man in der
Regel zuerst einen kleinen Tropfen der betreffenden Flüssigkeit auf
die Mitte des Objektträgers bringt; dann fängt man mit dem Spatel den
Schnitt auf und zieht ihn von da mit der Nadel auf den Objektträger.
Sehr feine Schnitte werden besser mit der Spitze eines Glasstabes
aufgefangen und durch Rollen desselben auf den Objektträger gebracht.
Liegt der Schnitt glatt auf, so bedeckt man ihn mit einem Deckglase.
Untersuchungen mit ~schwachen~ Vergrößerungen ~ohne~ Deckglas
sind nur zu alleroberflächlichster Orientierung, ob z. B. ein
Objekt hinreichend zerzupft ist, zulässig. In allen anderen
Fällen ist das Deckglas ~unentbehrlich~. Um sich davon zu
überzeugen, betrachte man einen unbedeckten Schnitt, decke
ihn dann mit dem Deckglase zu und betrachte wieder. Manches
gute Präparat, das man zu bedecken versäumt hat, erscheint
unbrauchbar. Untersuchungen mit starken Objektiven (Nr. 7) ohne
Deckglas sind im allgemeinen unzulässig; sie sollen nur bei
einzelnen Methoden, z. B. der Golgischen, vorgenommen werden.
Das Deckglas muß an den Kanten, ~nicht an den Flächen angefaßt
werden~; beim Bedecken wird das Deckglas mit der linken Hand auf den
Objektträger aufgesetzt und nun langsam auf das Präparat gesenkt, indem
man die Deckglasunterfläche mit einer in der rechten Hand gehaltenen
Nadel stützt. Einfacher ist es noch, an die Unterfläche des Deckglases
einen Tropfen der betreffenden Flüssigkeit anzuhängen und dann das
Deckglas sanft auf das Präparat fallen zu lassen. Die Flüssigkeit,
in welcher sich der Schnitt usw. befindet, muß genau den ~ganzen~
Raum zwischen Deckglas und Objektträger ausfüllen. Ist nicht genug
Flüssigkeit da (das ist an großen, unter dem Deckglas befindlichen
Luftblasen kenntlich), so setze man mit der Spitze eines Glasstabes
noch einen Tropfen der Flüssigkeit ~an den Rand~ des Deckglases.
Ist zuviel Flüssigkeit da -- und darin pflegt der Anfänger ganz
Besonderes zu leisten --, so ~muß~ man die über den Rand des Deckglases
hinausgetretene Flüssigkeit mit Filtrierpapier aufsaugen. ~Die
Oberfläche des Deckglases muß stets trocken sein.~ Kleine Luftblasen
unter dem Deckglase entferne man durch öfteres vorsichtiges Heben und
Senken desselben mit der Nadel (s. ferner S. 47).
1. Man versäume nie, ungefärbte wie gefärbte Schnitte in
Wasser oder Kochsalzlösung (S. 3) zu betrachten, da hier viele
Struktureigentümlichkeiten, z. B. Bindegewebsformationen scharf
hervortreten, während dieselben unter dem aufhellenden Einflusse des
Glyzerins oder des Xylolbalsams sich der Beobachtung fast gänzlich
entziehen. In Wasser (oder auch in Kochsalzlösung) eingelegte Objekte
lassen sich nicht aufheben.
2. Die in ~Glyzerin~ eingelegten Präparate lassen sich konservieren;
um die leichte Verschiebung des Deckglases zu verhindern, fixiere
man dasselbe mit Deckglaskitt (34, S. 7). Vorbedingung: Der Rand
des Deckglases muß ~vollkommen trocken sein~; denn nur an trockener
Glasfläche haftet der Kitt. Das ~Trocknen~ geschieht in der Weise, daß
man zuerst mit Filtrierpapier das über den Deckglasrand heraustretende
Glyzerin absaugt und dann mit einem mit 90%igem Alkohol befeuchteten
Tuche, das man sich über die Fingerspitze stülpt, sorgfältig den
Objektträger rings um das Deckglas abwischt, ohne letzteres zu
berühren. Nun erhitze man einen Glasstab und tauche ihn in den harten
Kitt.
Die Glasstäbe springen dabei sehr leicht, doch sind sie
Metallstäben vorzuziehen, da letztere sich zu rasch abkühlen. Man
kann dem Springen etwas vorbeugen, indem man die Glasstäbe unter
fortwährendem Drehen lange Zeit, bis zum Rotglühen, erhitzt; nur
kurz erhitzte Glasstäbe springen sofort bei dem Eintauchen in den
Kitt.
Man bringe zunächst vier Tropfen an die Ecken des Deckglases und ziehe
dann einen vollständigen Rahmen, der so beschaffen sein muß, daß er
einerseits das Deckglas, andererseits den Objektträger in einer Breite
von 1-3 mm deckt. Schließlich glätte man mit dem nochmals erhitzten
Stabe die Oberfläche des Rahmens.
In Glyzerin konservierte Präparate werden oft erst am zweiten oder
dritten Tage schön durchsichtig. Hämatoxylin und viele Anilinfarbstoffe
verblassen darin nach kurzer Zeit; Karmine sind dagegen haltbar.
3. Das Einschließen der Objekte in ~Xylolbalsam~ ist die beliebteste
Konservierungsmethode. Balsam hat dem Glyzerin gegenüber den Vorteil,
daß er die Farben erhält, ein Nachteil besteht aber darin, daß er viel
stärker aufhellt, als das verdünnte Glyzerin, und mancherlei feine
Strukturen dadurch vollkommen verschwinden macht.
Die in Wasser oder Alkohol befindlichen Schnitte können nicht ohne
weiteres in Balsam eingelegt werden, ~sie müssen vorher wasserfrei
gemacht werden~. Zu dem Zwecke werden die Schnitte mit der Nadel (sehr
feine Schnitte mit Spatel und Nadel) in ein bedecktes Uhrschälchen mit
5 ccm absolutem Alkohol gebracht. Dabei soll den Schnitten möglichst
wenig Wasser anhaften; benützt man einen Spatel, so sauge man von
diesem das Wasser mit Filtrierpapier ab; überträgt man den Schnitt
mit einer Nadel, so kann man gleichfalls durch leichtes Berühren
des Schnittes mit Filtrierpapier das Wasser entfernen. Im absoluten
Alkohol verweilen sie 2 Minuten (dünne Schnitte) -- 10 Minuten
(dickere Schnitte) oder beliebig länger. Dann übertrage man die von
Alkohol gleichfalls möglichst befreiten Schnitte zum ~Aufhellen~
in ein Uhrschälchen mit ca. 3 ccm Karbolxylol bzw. Xylol. Stellt
man das Schälchen auf schwarzes Papier, so kann man das allmähliche
Transparentwerden der Schnitte beobachten. Man vermeide in das
Uhrschälchen zu hauchen, eine sofortige Trübung des Xylols ist die
Folge. Werden einzelne Stellen der Schnitte nach 2-3 Minuten nicht
durchsichtig (solche Stellen erscheinen alsdann bei auffallendem Lichte
trübweiß, bei durchfallendem Lichte schwarzbraun), so ist der Schnitt
nicht wasserfrei gewesen und muß noch einmal in den absoluten Alkohol
zurückgebracht werden. Nach vollzogener Aufhellung wird der Schnitt auf
den trockenen Objektträger übertragen, das überflüssige Xylol durch
sanftes Aufdrücken eines Streifens glatten Filtrierpapiers entfernt und
rasch ein Deckglas aufgelegt, an dessen Unterfläche ein Tropfen Balsam
angehängt worden ist.
Der doppelt gefaltete Streifen wird mit der linken Hand am linken
Ende des Objektträgers festgehalten, der flach aufgesetzte
Zeigefinger der rechten Hand streicht unter sanftem Drucke den
auf dem Präparat liegenden Streifen in der Richtung von links
nach rechts.
Sollen mehrere Schnitte unter ~ein~ Deckglas gebracht werden, so ordne
man zuerst die Schnitte mit der Nadel nahe zusammen, breite dann den
Balsam auf der Deckglasunterfläche mit einem Glasstabe in gleichmäßig
dünner Schicht aus und lege dann das Deckglas auf. Große Luftblasen
werden durch Anfügen eines kleinen Tropfen Balsams an den Deckglasrand
vertrieben; am nächsten Tage sieht man, daß die Luftblase unter dem
Deckglase hervorgetreten ist. Kleine Luftblasen verschwinden von
selbst, können also unbeachtet bleiben.
Die Handhabung mit Xylol ist wegen seiner größeren
Empfindlichkeit gegen Wasser, und weil es leicht verdunstet,
schwieriger. Manches gute Präparat verdirbt noch im letzten
Augenblicke, weil man das Xylol verdunsten ließ.
Das zum Aufhellen benutzte Karbolxylol in der Uhrschale kann
wieder in die Flasche zurückgegossen werden.
Anfängern begegnet es nicht selten, daß der Balsam sich trübt und
schließlich das ganze Präparat oder Teile desselben undurchsichtig
macht. Der Grund liegt darin, daß der Schnitt nicht vollkommen
wasserfrei war. Bei geringer Trübung, die unter dem Mikroskop als
aus kleinsten Wassertröpfchen bestehend sich erweist, genügt oft ein
leichtes Erwärmen des Objektträgers; bei stärkeren Trübungen lege
man den ganzen Objektträger in Karbolxylol, hebe das Deckglas nach
einer halben Stunde vorsichtig ab, lege den Schnitt zwei Minuten
in Karbolxylol, um den anhaftenden Balsam zu lösen, und dann zur
vollkommenen Wasserentziehung in 4 ccm absoluten Alkohol, der nach 5
Minuten zu wechseln ist. Dann Karbolxylol und Balsam.
Der Balsam trocknet sehr langsam, die Objektträger dürfen deshalb nicht
auf die Kante gestellt werden.
Heißt es also in den allgemeinen oder speziellen Vorschriften
»Einschließen in Xylolbalsam nach § 10, 3 S. 45«, so kommen die
fertiggefärbten Schnitte (Häute usw.)
a) in 5 ccm Alkohol absolut. 5 (dicke Schnitte) 10 Minuten lang,
b) in 5 ccm Karbolxylol (oder Xylol) 2 " "
c) in Xylolbalsam.
Obenstehende Quantitäten sind für 3-6 Schnitte berechnet; bei
mehr Schnitten ist besonders die Menge des absoluten Alkohols zu
vergrößern.
§ 11. Untersuchung frischer Objekte.
Ich habe dieselbe an das Ende sämtlicher Methoden gestellt, weil
sie das Schwerste von allem ist und ein schon etwas geübtes Auge
voraussetzt. Diese Übung läßt sich am leichtesten durch vorhergehende
Untersuchung schon ~präparierter~ (gehärteter und gefärbter usw.)
Objekte aneignen; hat man einmal Struktureigentümlichkeiten deutlich
gesehen und studiert, so ist es nicht zu schwer, dieselben auch an
frischen Objekten wieder aufzufinden, obwohl die meisten Einzelheiten
an Deutlichkeit manches zu wünschen übrig lassen. Zu beachten ist hier
folgendes:
Objektträger und Deckglas dürfen nicht fett sein. Man reinige sie mit
Alkohol und trockne sie mit einem ganz reinen Tuche.
Zur Reinigung neuer Deckgläser von Fett empfiehlt es sich, die
Gläser auf einem Stück Schwarzblech 5 Minuten über der vollen
Flamme eines Bunsenbrenners zu erhitzen. Objektträger legt man
1/2 Stunde oder beliebig länger (Monate!) in Seifenwasser und
spült sie vor dem Gebrauch mit reinem Wasser ab. Unbrauchbare mit
Xylolbalsam und Deckglas bedeckte Objektträger werfe man in ein
großes Glas mit (90-96%igem) Alkohol. Nach einigen Tagen lassen
sich die Deckgläser leicht abheben. Dann Putzen mit Alkohol, dann
Seifenwasser.
Dann bringe man einen Tropfen Ringer- oder Kochsalzlösung (S. 3) auf
den Objektträger, lege dann ein ~kleines~ Stück des zu untersuchenden
Gegenstandes hinein und bedecke dasselbe mit dem Deckglase. Dabei muß
jeder Druck sorgfältig vermieden werden; bei sehr zarten Objekten
(s. spezielle Technik) bringe man an die Seiten derselben zwei feine
Papierstreifchen, auf denen dann das Deckglas ruht, ohne das Objekt
selbst zu drücken. Bedarf das Objekt keiner weiteren Behandlung, so
umrahme man, um Verdunstung zu verhindern, das Deckglas mit Paraffin.
Man schmelze auf einem alten Skalpell oder dgl. ein etwa linsengroßes
Stückchen Paraffin und lasse es, nicht von der Spitze, sondern von
der Schneide des Skalpells, an den Deckglasrand fließen; etwaige
Lücken kann man mit nochmals erhitztem Skalpell verstreichen. In den
meisten Fällen prüft man aber bei frischen Objekten die Einwirkung
gewisser Reagenzien (Essigsäure, Kalilauge, Farbstoffe) direkt unter
dem Mikroskop. Es handelt sich also darum, einen Teil des Medium, in
dem das Objekt sich augenblicklich befindet (also in unserem Falle
die Kochsalzlösung), zu entfernen und durch eine andere Flüssigkeit,
z. B. Pikrokarmin, zu ersetzen, also zu ~färben unter dem Deckglase~.
Zu diesem Zwecke bringe man zuerst an den rechten Deckglasrand mit
einem Glasstabe einen Tropfen. Reicht der Tropfen nicht ganz bis an
den Deckglasrand, so neige man nicht etwa den Objektträger, sondern
man führe mit einer Nadel den Tropfen bis zum Rande des Deckglases.
Man sieht nun, daß ein wenig der Farbe sich mit der Kochsalzlösung
mischt, aber ein ordentliches Fließen der Farbflüssigkeit unter das
Deckglas findet nicht statt. Um das zu ermöglichen, setze man an den
linken Rand des Deckglases etwas Filtrierpapier, und alsbald sieht man
das Pikrokarmin die ganze Unterfläche des Glases einnehmen. Wenn der
erste Tropfen eingedrungen ist, setze man je nach Belieben 2-3 Tropfen
an den rechten Deckglasrand. Nun schiebe man das Filtrierpapier zur
Seite und lasse die Farbe wirken; ist die Färbung vollendet -- das
läßt sich ja stets unter dem Mikroskop kontrollieren --, so bringe
man jetzt an den rechten Deckglasrand einen Tropfen z. B. verdünntes
Glyzerin, dem man bei Pikrokarminfärbungen soviel Essigsäure zusetzt,
als von einer einmal eingetauchten Stahlnadel abtropft (also einen ganz
kleinen Tropfen), während links wieder das Filtrierpapier angesetzt
wird. Auf diese Weise kann man eine ganze Reihe von Flüssigkeiten
unter dem Deckglase ~durchleiten~ und so ihre Wirkungen auf die Gewebe
erproben. Einzelne der Flüssigkeiten, z. B. Pikrokarmin, besonders nach
vorhergegangener Osmiumfixierung, färben sehr langsam und müssen sehr
lange mit den Objekten in Berührung bleiben. Man verhindert alsdann die
Verdunstung, indem man das Präparat in die ~feuchte Kammer~ verbringt.
Zur Herstellung der feuchten Kammer braucht man einen Porzellanteller
und einen kleinen Glassturz von mindestens 9 cm Durchmesser. Ein
Topf, ein größeres Präparatenglas usw. tut dieselben Dienste. In den
Teller gieße man Wasser ca. 2 cm hoch, dann stelle man in die Mitte
ein Glasnäpfchen oder eine auf vier Holzfüßen stehende Korkplatte; auf
diese wird der Objektträger mit dem Präparat gelegt und das Ganze mit
dem Glassturze bedeckt, dessen freier Rand überall in das Wasser taucht.
§ 12. Vitale Färbung.
Im Gegensatz zu der Strukturfärbung fixierter Objekte lassen sich in
lebenden Zellen mit bestimmten Farbstoffen Effekte erzielen, die auf
der Lebenstätigkeit der Zellen beruhen. Aus diesem Grunde ist jede
»Vitalfärbung« ein hochkomplizierter biologischer Vorgang.
Manche ~basische Farbstoffe~ färben in vielen lebenden Zellen gewisse
tropfige Zelleinschlüsse, ohne das übrige Zytoplasma und die Zellkerne
mitzufärben. Man kann diese Färbung auch an frischen, dem Körper
entnommenen Geweben ausführen, indem man sie in einem Uhrschälchen
in eine Ringerlösung überführt, der 1/100-2/100 Gewichtsprozente
~Neutralrot~ beigemischt sind, so daß also 1/10000-2/10000
Neutralrotlösung verwandt wird. Nach 15-30 Minuten sieht man eine
langsam zunehmende Färbung der tropfigen Zelleinschlüsse. In vielen
Fällen erleichtert diese Färbung die Beobachtung nicht unwesentlich.
Durch zu starke Farbstoffkonzentrationen sterben die Zellen unter
intensiver diffuser Farbstoffaufnahme in Kern und Zytoplasma ab.
Viele ~saure Farbstoffe~, unter ihnen an erster Stelle ~Trypanblau~ und
~Lithionkarmin~, werden vom lebenden Organismus in vielen Zellen in
Vakuolenform abgelagert. Da hierbei eine konstante Auswahl von Zellen
an der Speicherung teilnimmt, ist diese Art der vitalen Färbung für
die Untersuchung normaler wie pathologischer Vorgänge im Organismus
besonders wichtig. Man verwendet Trypanblau 1,0 auf 100,0 Aq. dest.
und spritzt Mäusen davon subkutan je 1,0 ccm 6-8mal in Abständen von
4-5 Tagen ein, wodurch eine dauerhafte Speicherung erzielt wird. Nach
Tötung konserviert man die ganze Maus (nach breiter Eröffnung der
Körperhöhlen) in Formalin 10%ig (s. Nr. 2, S. 14) und verarbeitet das
Material entweder mit der Gefrierschnittmethode (s. S. 21) oder nach
Einbettung in Zelloidin.
Auf einzelne besondere Anwendungsweisen der vitalen Färbung wird im
Speziellen Teil hingewiesen.
§ 13. Aufbewahren der Dauerpräparate.
Die fertigen Präparate müssen sofort etikettiert werden. Man nehme
entweder gummierte Papieretiketten, oder solche aus ca. 1,2 mm dicker
Pappe, welche man mit Fischleim (»Syndetikon«) aufklebt. Dadurch
werden besondere Schutzleisten überflüssig; die Objektträger können
aufeinandergelegt werden, ohne daß die Präparate gedrückt werden. Die
Etiketten sollen möglichst groß (von ca. 2 cm Seite bei Objektträgern
englischen Formates) und mit dem Namen des Tieres, des Organs und
womöglich mit kurzer Andeutung der Methode versehen sein. Zum
Aufbewahren verwende man Kästen, in denen die Objektträger liegen, oder
solche, in denen sie auf der Kante stehen.
Die besten und billigsten Kästen erhält man bei ~Th. Schroeter,
Leipzig-Connewitz~.