Einleitung.
Die wenigsten Organe des tierischen Körpers sind so beschaffen, daß
sie ohne weiteres der mikroskopischen Untersuchung zugänglich sind.
Sie müssen einen gewissen Grad von Durchsichtigkeit besitzen, den
wir dadurch erreichen, daß wir die Organe entweder in ihre Elemente
zerteilen, die Elemente ~isolieren~, oder in dünne Schnitte zerlegen,
~schneiden~. Nun haben aber wiederum die wenigsten Organe eine
Konsistenz, welche sofortiges Anfertigen genügend feiner Schnitte
gestattet; sie sind entweder zu weich, dann muß man sie ~härten~,
oder zu hart (verkalkt), dann muß man sie ~entkalken~. ~Härten~ und
~Entkalken~ kann jedoch nicht an frischen Objekten vorgenommen werden,
ohne deren Struktur zu schädigen; es muß demnach beiden Prozeduren ein
Verfahren vorausgehen, welches eine rasche Erstarrung und damit eine
Festigung der kleinsten Teilchen ermöglicht; dieses Verfahren nennt
man ~fixieren~. Das Anfertigen feiner Schnitte ist demnach meist nur
nach vorausgegangener Fixierung und Härtung (eventuell nachfolgender
Entkalkung) des betreffenden Objektes möglich. Aber auch die Schnitte
beanspruchen noch weitere Behandlung; sie können entweder sofort
durchsichtig gemacht werden, durch ~Aufhellungs~mittel, welche auch mit
Erfolg bei frisch untersuchten Objekten angewendet werden, oder sie
können vor der Aufhellung ~gefärbt~ werden. Die Farbstoffe sind für
die mikroskopische Untersuchung unschätzbare Hilfsmittel; sie lassen
sich auch auf frische, ja selbst auf lebende Organe applizieren; eine
große Zahl der wichtigsten Tatsachen ist nur mit Hilfe der Farbstoffe
aufgedeckt worden. In die Gefäße eingespritzt, ~injiziert~, lehren sie
uns die Verteilung und den Verlauf der feinsten Verzweigungen derselben
kennen.
§ 1. Beschaffenheit des Materials.
Für Studien über die Formelemente und die einfachsten Gewebe sind
Amphibien: Frösche, Molche (am besten der gefleckte Salamander, dessen
Elemente sehr groß sind) zu empfehlen, für Studien der Organe dagegen
nehme man Säugetiere. Für viele Fälle genügen hier unsere Nagetiere
(Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus), ferner junge Hunde, Katzen
usw. Doch versäume man keine Gelegenheit, die Organe des Menschen sich
zu verschaffen. Vollständig frisches Material ist in chirurgischen
Kliniken zu haben; im Winter sind viele Teile selbst vor 2-3 Tagen
Verstorbener noch brauchbar.
Im allgemeinen empfiehlt es sich, die Organe lebenswarm einzulegen.
Um möglichst rasch dieser Aufgabe sich zu entledigen, ist es geboten,
~zuerst~ die zur Aufnahme der Objekte bestimmten Gläser mit der
betreffenden Flüssigkeit zu füllen und mit einer Objekt, Flüssigkeit
und Datum (eventuell Stunde) anzeigenden Etikette zu versehen;
~danach~ lege man die zur Sektion nötigen Instrumente (das anatomische
Präparierbesteck) zurecht und ~dann~ erst töte man das Tier. Dem
lebenden Tiere Teile zu entnehmen, ist eine nutzlose Grausamkeit.
§ 2. Töten und Sezieren der Tiere.
Amphibien durchschneide man mit einer starken Schere die
Halswirbelsäule und zerstöre Hirn und Rückenmark vermittelst einer von
der Wunde aus in die Schädelhöhle bzw. in den Wirbelkanal eingestoßenen
Nadel. Säugetieren durchschneide man den Hals mit einem kräftigen,
bis zur Halswirbelsäule reichenden Schnitt oder man töte sie mit
Chloroform, das man auf ein Tuch gießt und so den Tieren vor die Nase
drückt. Kleine, bis 4 cm große Tiere, Embryonen, können im ganzen in
die Fixierungsflüssigkeit geworfen werden. Nach ca. 6 Stunden öffne man
diesen die Bauch- und Brusthöhle durch Einschnitte. Bei der Sektion
halte womöglich ein Gehilfe die Extremitäten; kleine Tiere kann man
mit starken Stecknadeln an den Fußflächen auf Kork- oder Wachsplatten
spannen. Die Organe müssen sauber herauspräpariert werden (am besten
mit Pinzette und Schere), Quetschen und Drücken der Teile, Anfassen
mit den Fingern ist vollkommen zu vermeiden. Die Pinzette darf ~nur
am Rande~ der Objekte eingreifen; anhängende Verunreinigungen,
Schleim, Blut, Darminhalt dürfen nicht mit dem Skalpell abgekratzt
werden, sondern sind durch langsames Schwenken in der betreffenden
Fixationsflüssigkeit oder in Ringerscher Lösung (s. S. 4) zu entfernen.
Methoden.
Bei den im folgenden angegebenen Methoden ist es nicht zu vermeiden,
daß Scheren, Pinzetten, Nadeln, Glasstäbe usw. mit den verschiedensten
Flüssigkeiten, z. B. Säuren, benetzt werden. Man reinige die
Instrumente ~sofort~ nach dem Gebrauche durch Abspülen in Wasser und
Abtrocknen. Vor allem vermeide man, einen z. B. mit einer Säure oder
mit einem Farbstoff benetzten Glasstab in eine andere Flüssigkeit zu
tauchen. Abgesehen davon, daß die Reagenzien dadurch verdorben werden,
wird oft das Gelingen der Präparate hierdurch gänzlich vereitelt.
Gläser, Uhrschalen usw. sind leicht zu reinigen, wenn dies sofort nach
der Benützung geschieht; läßt man dagegen z. B. einen Farbstoffrest in
einem Glase antrocknen, so ist das Reinigen immer sehr zeitraubend.
Man versäume also nie, auch die Gläser ~sofort~ nach dem Gebrauche zu
reinigen; Uhrschalen werfe man wenigstens in eine Schüssel mit Wasser.
Alle Gefäße, in denen man isoliert, fixiert, härtet, färbt usw., müssen
geschlossen gehalten (Uhrschalen decke man mit einer zweiten Uhrschale
zu, wenn die Manipulationsdauer 10 Minuten übersteigt), und dürfen
nicht in die Sonne gestellt werden.
§ 3. Isolieren.
Man isoliert entweder durch Zerzupfen der frischen Objekte oder nach
vorhergehender Behandlung der Objekte mit lösenden Flüssigkeiten,
welche ein Zerzupfen ganz oder teilweise unnötig machen. Es gehört
zu den schwierigen Aufgaben, ein gutes Zupfpräparat anzufertigen.
Viel Geduld und genaue Erfüllung nachstehender Vorschriften sind
unerläßlich. Die Nadeln müssen spitz und ganz rein sein; man spitze
und poliere sie zuvor auf dem angefeuchteten Schleifsteine. Das
~kleine~ Objekt, von höchstens 4 mm Seite, wird nun in ~einen~ kleinen
Tropfen auf den Objektträger gelegt, und wird, wenn es farblos ist,
auf schwarzer, wenn es dunkel (etwa gefärbt) ist, auf weißer Unterlage
zerzupft. Ist das Objekt faserig (z. B. ein Muskelfaserbündel), so
setze man beide Nadeln an dem einen Ende des Bündels an und zerreiße
dasselbe der Länge nach in zwei Bündel; das eine dieser Bündel wird
auf dieselbe Weise, immer durch Ansetzen der Nadel an das ~Ende~,
wieder in zwei Bündel getrennt und so fort, bis ganz feine einzelne
Fasern erzielt sind. Durch Betrachtung des (unbedeckten) Präparates mit
schwacher Vergrößerung kann man kontrollieren, ob der nötige Grad von
Feinheit erreicht ist.
In wenig Flüssigkeit liegende, nicht mit einem Deckglase bedeckte
Präparate sehen oft unklar aus, zeigen schwarze Ränder usw.,
Fehler, die durch Zusatz eines hinreichend großen Tropfens und
durch ein Deckglas wieder ausgeglichen werden.
Als isolierende Flüssigkeiten sind zu empfehlen:
a) Für Epithelzellen
ist ~Ranvier~s Drittelalkohol (s. S. 4) ein ausgezeichnetes
Isolationsmittel. Man lege Stückchen von 5-10 mm Seite (z. B. der
Darmschleimhaut) in ein ~relativ geringes~ Quantum (ca. 10 ccm) dieser
Flüssigkeit ein. Nach 5 Stunden (bei geschichtetem Pflasterepithel
nach 10-24 Stunden und später) werden die Stückchen mit einer Pinzette
~vorsichtig~, ~langsam~ herausgehoben und ein paar Mal ~leicht~
auf einen Objektträger aufgestoßen, der mit ~einem~ Tropfen der
gleichen Flüssigkeit bedeckt ist. Durch das Aufstoßen fallen viele
Epithelzellen isoliert ab, manchmal ganze Fetzen, die man nur mit
der Nadel leicht umzurühren braucht, um eine vollkommene Isolation
zu erzielen. Nun lege man ein Deckglas auf (S. 44) und untersuche.
Will man das Objekt ~färben~, so bringe man die ~ganzen~ Stückchen
vorsichtig aus dem Alkohol in ca. 6 ccm Pikrokarmin (S. 8). Nach 2-4
Stunden wird das Stückchen sehr vorsichtig in ca. 5 ccm destilliertes
Wasser gelegt und nach fünf Minuten auf den Objektträger aufgestoßen,
der diesmal mit einem Tropfen verdünnten Glyzerins (30, S. 7) bedeckt
ist. Deckglas. Das Präparat kann konserviert werden.
b) Für Muskelfasern, Drüsen
eignet sich 35%ige Kalilauge (s. S. 7). Stückchen von 10-20 mm Seite
werden in 10-20 ccm dieser Flüssigkeit eingelegt; nach etwa einer
Stunde sind die Stückchen in ihre Elemente zerfallen, die mit Nadeln
oder einer Pipette herausgefischt und in einem Tropfen der gleichen
Kalilauge unter Deckglas betrachtet werden. Jedes Hervorquellen
der Kalilauge unter dem Deckglas ist streng zu vermeiden, da die
Metallfassung des Objektives dadurch in Gefahr kommt! Verdünnte
Kalilauge wirkt ganz anders; würde man die Elemente in einem Tropfen
Wasser betrachten wollen, so würden dieselben durch die nunmehr
verdünnte Lauge in kürzester Zeit zerstört werden. Gelingt die
Isolation nicht (statt dessen tritt zuweilen eine breiige Erweichung
der Stückchen ein), so ist die Kalilauge zu alt gewesen. Man wende
deshalb stets frisch bezogene Lösungen an. Auch die gelungenen
Präparate lassen sich nicht konservieren.
Ferner ist geeignet eine Mischung von chlorsaurem Kali und
Salpetersäure. Man bereite sich dieselbe, indem man in 20 ccm reine
Salpetersäure (S. 5) so viel chlorsaures Kali (ca. 5 g) wirft, daß ein
ungelöster Satz am Boden bleibt. Nach 1-6 Stunden (manchmal später)
ist das Objekt genügend gelockert und wird nun in 20 ccm destilliertes
Wasser übertragen, in dem es eine Stunde bleibt, aber ohne Schaden auch
8 Tage verweilen kann. Dann wird es auf den Objektträger übertragen,
wo es in einem Tropfen dünnen Glyzerins (30, S. 7) mit Leichtigkeit
zerzupft werden kann. Wenn die Salpetersäure gut ausgewaschen ist,
lassen sich die Präparate konservieren und auch unter dem Deckglase
färben (S. 47). Einlegen der noch nicht zerzupften Stückchen in
Pikrokarmin (s. die Isolation von Epithelzellen) gelingt nicht, da
diese Farbflüssigkeit die Objekte brüchig macht.
c) Für Drüsenkanälchen
ist vorzüglich das Einlegen kleiner Stücke (von ca. 1 cm Seite) in 10
ccm reine Salzsäure. Nach 10-20 Stunden werden die Stückchen in ca. 30
ccm destilliertes Wasser gebracht, das innerhalb 24 Stunden mehrmals
gewechselt werden muß. Die Isolation gelingt dann leicht durch
vorsichtiges Ausbreiten des Stückchens mit Nadeln in einem Tropfen
verdünntem Glyzerin. Die so hergestellten Präparate können konserviert
werden.
§ 4. Fixieren.
~Allgemeine Regeln.~ 1. Zum Fixieren muß stets ~reichliche~, das
Volum des zu fixierenden Objektes 50-100mal übertreffende Flüssigkeit
verwendet werden. 2. Die Flüssigkeit muß ~stets~ klar sein, sie
muß, ~sobald sie trübe~ geworden ist, gewechselt, d. h. durch
frische Flüssigkeit ersetzt werden. Die Trübung tritt oft schon eine
Stunde (oder früher) nach dem Einlegen ein. 3. Die zu fixierenden
Objekte sollen ~möglichst~ klein sein, im allgemeinen 1-2 ccm nicht
überschreiten. Das Zerkleinern der Stücke geschieht mit scharfem
Rasiermesser unter möglichster Vermeidung von Druck, bei weichen
Organen erst eine oder mehrere Stunden nach dem Einlegen in die
Fixierungsflüssigkeit, wenn die Stücke schon etwas fester geworden sind.
Sollte die Erhaltung des ganzen Objektes nötig sein (z. B.
zur nachherigen Orientierung), so mache man wenigstens viele
tiefe Einschnitte (5-10 Stunden nach dem ersten Einlegen) in
dasselbe. Die Objekte sollen nicht am Boden liegen, man hänge
sie entweder im Glase auf oder man bringe auf den Boden des
Gefäßes eine mehrere Zentimeter hohe Lage entfetteter Watte oder
Glaswolle; dadurch wird erreicht, daß die im Objekt enthaltene
Flüssigkeit zu Boden sinkt und die Fixierungsflüssigkeit rasch
und in voller Konzentration eindringt. Bei Warmblütern ist zu
empfehlen das halbstündige Einlegen in erwärmte (auf 39° C)
Fixierungsflüssigkeit. Kleine und zarte Objekte (z. B. Embryonen
-- 3 mm Länge) werden nur kürzere Zeit, z. B. in Zenker (S. 16)
nur eine Stunde fixiert.
1. ~Alkohol absolutus~ ist für Drüsen, Haut, Blutgefäße usw. sehr
geeignet. Er wirkt zugleich als Härtungsmittel. In absolutem Alkohol
eingelegte Objekte können schon nach 24 Stunden geschnitten werden.
Man schiebe die Verarbeitung der in absolutem Alkohol fixierten
Objekte nicht zu lange Zeit hinaus, da die Elemente doch
allmählich leiden; man schneide nach 3-5 Tagen. Will man die
Objekte noch weiter aufheben, so bringe man sie von da ab in
90%igen Alkohol. Schnitte von Objekten, die nur 24 Stunden in
absolutem Alkohol gelegen hatten, färben sich zuweilen schlecht.
Er eignet sich vorzugsweise zur raschen Herstellung von Präparaten.
Besonders zu beachten ist folgendes: 1. Der absolute Alkohol muß, auch
wenn er nicht getrübt ist, nach 3-4 Stunden gewechselt werden. 2. Man
vermeide, daß die eingelegten Objekte auf dem Boden des Glases fest
aufliegen oder gar festkleben: man hänge deshalb die Objekte entweder
an einem Faden im Alkohol auf, oder lege auf den Boden des Glases ein
Bäuschchen Watte.
Nicht absoluter (z. B. 90%iger) Alkohol wirkt ganz anders, schrumpfend
und kann deshalb nur für besondere Zwecke statt des absoluten Alkohols
verwendet werden.
2. ~Formol~ 10%ige Lösung (10 ccm Formol [S. 5] zu 90 ccm destilliertem
Wasser).
Die Objekte verweilen darin 48 Stunden,
kommen dann in Alkohol 96% mindestens 48 "
Diese Formolmischung wird vielfach beim Gebrauch des
Gefriermikrotoms verwendet. Die Objekte können Monate lang in
der Mischung verbleiben; vor dem Mikrotomieren schneide man eine
Scheibe von ca. 5 mm Dicke von dem Objekt und lege sie 24 Stunden
lang in Wasser. Dann ohne Alkoholhärtung Aufsetzen auf das
Mikrotom (s. S. 21.)
Formol wirkt ähnlich wie Osmiumlösungen[17].
Stärkere (25-50%ige) Lösungen sind zwar ein gutes Mittel für
Erhaltung von Zellstrukturen, machen aber das Bindegewebe sehr
hart.